摘要
背景:细菌的多重耐药性是全球公共卫生面临的主要威胁之一，其主要产生原因是抗生素的不恰当使用甚至滥用。多重耐药(MDR)肺炎克雷伯菌（肺克菌）是临床最常见的耐药菌之一，主要引起各种严重器官感染，且具有较高的致死率。在临床中，由于缺乏抗生素敏感性和细菌病原体的快速鉴别诊断方法，导致了广谱抗生素的频繁和不必要的使用，其中包含碳青霉烯类抗生素。碳青霉烯类抗生素一直是治疗肺克菌感染的重要手段。尽管在感染耐药肺克菌的情况下，不恰当使用甚至滥用细菌耐受的碳青霉烯类药物在内的抗生素的低效或无效性已被广泛认知，但其是否或如何影响免疫系统却仍未被充分了解。 已有研究显示，抗生素的压力会促进革兰氏阴性菌释放外膜囊泡(OMVs)。OMVs是直径20-250nm的囊泡状结构，由外膜和周质空间成分以及细菌增殖过程中释放的细胞质成分组成。OMVs在细菌致病机制、方面发挥着重要作用。OMVs通过将细菌毒力转移到宿主细胞，直接调控细菌与宿主的相互作用。OMVs中最丰富的成分之一是脂多糖(LPS)，它是一种强的免疫刺激剂，能够刺激巨噬细胞等免疫细胞的功能如炎症小体激活，释放炎性介质等，近年报道其可引起非经典途径细胞焦亡。细胞焦亡被描述为炎性小体诱导的细胞死亡，并与白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟和释放有关。病原体和宿主之间存在着一场平衡细胞焦亡的斗争，其结果决定了被感染个体的疾病发展。在大多数感染情况下，焦亡有助于调动免疫系统，有效清除入侵的病原体。然而，过度的细胞焦亡引起的过度炎症反应会损害宿主器官，甚至导致致命的感染性休克。因此，焦亡的程度和范围对被感染的病原体和宿主的命运至关重要。 基于抗生素压力下细菌可大量产生OMVs这一发现，我们提出了本研究的关键科学问题:临床中不恰当甚至滥用抗生素是否会对机体免疫系统产生显著且极可能不利的影响？ 方法:以亚胺培南（碳青霉烯类）抗生素治疗耐药肺克菌为模型，考察不合理使用抗生素（使用肺克菌耐受的抗生素）对小鼠存活率，体内炎症水平，菌载量变化的影响。通过利用OMVs产生的抑制剂或caspase11酶活性抑制剂，初步考察OMVs及细胞焦亡是否可能在炎症应答过程中发挥重要的作用。此外，应用体外实验考察亚胺培南刺激与否对OMVs产生、蛋白组成情况、物理性质、以及促巨噬细胞吞噬、炎性介质释放及焦亡的影响;利用RNA干扰技术验证GroEL蛋白与LOX-1受体的结合对巨噬细胞焦亡及炎症因子释放的重要性。进一步，利用体内直接给与亚胺培南刺激与否情况下制备的OMVs，明确OMVs及抗生素压力下产生的OMVs对炎症应答的影响及差异。最后，利用不同类型的抗生素处理MDR耐药肺克菌感染的小鼠，初步探讨本论文研究关键发现的普遍性。 结果:1）亚胺培南恶化了MDR肺克菌肺炎模型小鼠的炎症反应（包括IL-1β，IL-18，TNF-α和IL-6炎症因子的升高及募集了更多的炎性细胞至肺部），增加了小鼠死亡率，而在小鼠体内的菌载量并没有明显变化;2）当肺炎克雷伯菌的OMVs的产生被抑制或者OMVs激活的caspase-11酶活性被抑制时，小鼠的炎症反应和死亡率都降低了，提示加重的炎症反应是由耐药肺炎克雷伯菌释放的OMVs介导的，且焦亡可能扮演了重要角色，同时两种抑制剂单独均不影响菌载量的变化;3）体外抗生素刺激实验显示，亚胺培南增多了肺炎克雷伯菌OMVs的释放颗粒数及携带蛋白的含量，同时增加了GroEL在OMVs上的膜表面呈递;4)亚胺培南压力下产生的OMVs(KOMVs-IMP)通过GroEL与巨噬细胞表面的LOX-1受体结合，较之无压力下产生的OMVs(KOMVs)增强了巨噬细胞对其的吞噬，并介导了更多的LPS进入细胞内;5)KOMVs-IMP较之KOMVs更强烈地引起巨噬细胞发生焦亡，体现在溶胀的细胞形态、提升的焦亡执行蛋白GSDMD-NT水平、增强的死亡特征分子如AnnexinⅤ的呈现及LDH的释放，以及炎症因子IL-1β，IL-18和TNF-α的产生;6）通过RNA干扰的方式抑制巨噬细胞LOX-1的表达可抑制OMVs引起的细胞焦亡和炎症因子IL-1β，IL-18和TNF-α的释放;7）在滴鼻或腹腔直接给与体外制备的OMVs的小鼠攻击实验中，KOMVs-IMP比KOMVs造成更高的致死率、引起更强的炎症因子应答;8）实验采用的几种碳青霉烯类抗生素都如亚安培南一样，明显增加肺克菌分泌的OMVs数量与GroEL表达，并导致更高的感染小鼠死亡率。 结论:我们利用小鼠模型研究及体内外机制验证揭示，多重耐药肺克菌感染中，抗生素不恰当使用可诱导GroEL高表达的OMVs的大量产生，介导了巨噬细胞焦亡及大量炎性介质释放，从而导致严重的炎症应答及小鼠死亡。这一发现强调了抗生素不恰当使用甚至滥用不仅无助于耐药菌的清除，反而促使细菌过度刺激免疫系统，造成对机体的更大危害。
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