摘要
骨骼发育由多种转录因子和信号通路调控，当骨发育关键基因发生突变，可能会导致身体畸形或者骨质疏松之类的骨骼疾病，严重时可导致早期胚胎死亡。斑马鱼作为一种模式生物，其wnt16基因与人类WNT16基因具有高度同源性，并且作为典型的Wnt配体，主要参与脊椎动物骨骼发育和体内稳态的调节。因此，本研究基于研究室前期建立的wnt16敲除品系，旨在探究敲除wnt16基因对斑马鱼骨骼发育及相关信号通路的影响。本研究得到的主要结果与结论有： 1.wnt16斑马鱼基因型与表型分析：通过基因型鉴定wnt16斑马鱼为纯合突变体，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析发现wnt16-/-mRNA表达量显著降低。对突变基因wnt16进行蛋白结构预测，与野生型相比，三级结构发生改变。随后整体原位杂交技术（WISH）观察wnt16基因在斑马鱼中的表达，该基因于头、胸鳍芽和咽弓软骨等骨组织中选择性表达。番红O-固绿染色结果发现，wnt16-/-软骨受到损伤，细胞排列不均匀，数目减少等。这些结果表明wnt16基因敲除成功并且在骨相关的部位选择性表达，进而影响斑马鱼的软骨发育和骨骼形成。 2.转录组差异表达基因的分析：转录组数据筛选获得773个共表达差异基因。对其进行基因本体（GO）富集及京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析，发现下调基因主要富集在与骨发育相关的mTOR、FoxO和VEGF等信号通路，而上调基因并未富集到与骨相关的信号通路。蛋白-蛋白互作网络（PPI）建立了wnt16与下调基因的网络关系。qRT-PCR验证了转录组数据的可靠性。分析结果表明，敲除斑马鱼wnt16基因可能抑制mTOR、FoxO和VEGF等信号通路，从而导致斑马鱼骨骼发育的异常。 3.加权基因共表达网络分析（WGCNA）：将基因表达量即FPKM值大于5的基因划分为12个模块，并将其与表型数据相关联，得到相关系数最高的yellow模块。采用Cytohubba方法得到该模块的hub基因，分析结果表明polr1c、ska1、dsn1等十个hub基因可作为影响骨骼发育的潜在基因。 本研究利用斑马鱼模型证实了敲除wnt16基因影响骨骼发育以及相关信号通路的表达，并且还发现了部分与骨骼发育相关的潜在基因，为wnt16基因的研究提供了重要参考。
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