摘要
牙再植术是治疗牙齿完全脱位的首选方法，由于患者就诊时间不及时临床上所行的治疗多为延期再植。学者将离体15分钟以上的所行的牙齿再植术称为延期再植，延期再植术成功的关键在于离体牙牙周膜成纤维细胞（periodontalligamentfibroblasts,PDLFs）活性的保存，离体30分钟以上PDLFs活力大大降低，1小时以上牙根表面几乎无存活细胞。受损坏死的PDLFs释放大量炎症因子，炎症微环境下细胞无法增殖迁移到损伤部位分泌细胞外基质形成新的牙周膜（periodontalligament,PDL）纤维的再附着，导致牙根吸收和牙周膜愈合不佳。随着对离体牙保存介质的不断研究，牙根表面的PDLFs可以在体外存活较长时间，降低了术后牙根吸收的严重程度，然而牙周膜的愈合却极少发生。因此，在此基础上寻找一种可以促进延期再植术后PDL修复再生的物质十分重要。 在正常生理状态下，PDLFs覆盖于牙根和牙槽骨表面，通过分泌多种细胞外成分起到维护牙周组织稳定和保护牙根完整的作用，近年来越来越多的研究表明，外泌体是参与生物活性分子转运的重要组成部分。外泌体是一种被细胞释放的具有双层膜囊结构的囊泡，包含来源细胞的蛋白、mRNA等多种活性分子，通过融合和/或内吞的方法转移到靶细胞，起到调控组织生长发育的作用。有实验研究表明，正常生理状态下间充质细胞和成纤维细胞分泌的外泌体具有促进组织损伤修复和炎症消退的作用。然而，外泌体的生物学作用取决于环境因素和细胞的状态。有文献报道，炎症刺激下PDL细胞来源的外泌体导致成骨细胞的成骨下降骨生成减少，抑制外泌体的分泌挽救了部分成骨活性。再植术后炎症环境下，PDLFs分泌的外泌体对周围细胞的功能有何影响，是否可以通过添加外源性条件培养细胞来源外泌体来调控牙周膜的愈合尚不清楚。 因此，本实验通过探究LPS刺激下人PDLFs来源外泌体（L-Exos）和正常条件培养PDLFs来源外泌体（N-Exos）对细胞增殖、迁移和胶原合成的影响，并建立大鼠延期牙再植术模型，通过添加健康人PDLFs来源的外泌体，观察其对术后牙根吸收和牙周膜愈合的作用。 本研究分为以下两个部分： 第一部分不同状态下人PDLFs来源的外泌体对细胞生物学行为的影响 目的：探究炎症刺激下人PDLFs来源的外泌体和健康人PDLFs来源外泌体对细胞生物学行为的影响。 方法：体外分离培养原代人PDLFs，分离提取鉴定LPS诱导下PDLFs来源的外泌体（L-Exos）和正常条件培养基培养PDLFs来源的外泌体（N-Exos），透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope,TEM）、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticletrackinganalysis,NTA）及WesternBlot鉴定提取的细胞外囊泡。PKH26红色荧光标记外泌体，观察PDLFs对外泌体的摄取，CCK-8和划痕实验观察两种外泌体对PDLFs增殖和迁移的影响，RT-qPCR检测不同来源的外泌体对PDLFs胶原合成相关基因的影响。 结果：实验鉴定提取的细胞外囊泡为外泌体，30min已有外泌体聚集在牙周膜细胞周围，6h有大量的外泌体与牙周膜细胞共定位，表明PDLFs可以摄取外泌体。CCK8和细胞划痕实验证明，与L-Exos组相比N-Exos组显著促进了PDLFs细胞的增殖和迁移，RT-qPCR结果显示，N-Exos促进了PDLFs胶原合成相关基因COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和periostin的表达。 结论：外泌体可作用于PDLFs，且相较于L-Exos，N-Exos显著促进了PDLFs的增殖、迁移和胶原合成。 第二部分健康人PDLFs来源外泌体对大鼠延期牙再植术后牙周膜愈合的作用 目的：探究健康hPDLFs来源的外泌体对大鼠延期牙再植术后PDL损伤修复和新PDL纤维再附着的作用。 方法：45只雄性6周龄SD大鼠随机分为对照组、汉克斯平衡盐溶液（hank’sbalancesaltsolution,HBSS）组和外泌体（Exos）组，建立大鼠右上颌第一磨牙延期牙再植术模型，对照组磨牙拔出后不做任何处理，脱位牙置于200μlEP管中中；HBSS组脱位牙浸泡在HBSS中，外泌体组脱位牙浸泡在含40μg外泌体的HBSS中。30min后将牙齿再植回牙槽窝，术后1、2、4周收样，HE、TRAP染色、Masson染色、免疫组织化学及免疫荧光、TUNEL染色观察延期牙再植术后牙周膜细胞增殖凋亡、炎症、胶原合成和牙周膜愈合情况。 结果：术后组织学切片表明，对照组牙根表面出现累及牙本质深层的吸收陷窝，内含大量破骨细胞，4周时牙根断裂，牙根连续性被破坏。HBSS组牙根表面出现大小不一的吸收陷窝，随着时间延长不断累及牙本质深层，破骨细胞数量逐渐减少，4周时仅有少量细胞附着于牙根表面。外泌体组牙根表面更平整，吸收陷窝仅位于牙骨质层和牙本质浅层，破骨细胞2周时显著减少,4周牙根表面光滑连续。外泌体组早期牙周膜内炎症浸润与对照组和HBSS组相比显著减轻，TNF-α阳性的炎症细胞较少，牙周膜间隙内仅有少量凋亡的细胞，PCNA阳性的增殖细胞分布于整个PDL内，COL-Ⅰ和periostin合成增加，4周时形成一端插入牙槽骨、一端插入牙骨质的斜行纤维。 结论：外源性健康PDLFs来源的外泌体减少大鼠延期牙再植术后牙根吸收，促进了牙周膜修复再生。
NETL