摘要
铜(Cu)是分布广泛的环境污染物之一。虽然Cu是生物体的必需营养元素，但过量的Cu也会对生物体产生毒性效应。克氏原鳌虾(Procambarusclarkii)是我国重要的淡水养殖物种，其生活水域极易受到重金属污染，如含Cu杀虫剂的过量使用和工业Cu污水排放。因此，本文采用环境相关浓度的Cu暴露克氏原鳌虾7d，检测了不同组织中Cu的含量。在7d暴露期后又进行了7d清除实验，通过测定肝胰腺抗氧化系统和Cu稳态系统相关指标的变化，探究克氏原鳌虾在Cu胁迫和去除胁迫后如何应对Cu蓄积及Cu诱导的毒性效应。更进一步地，本研究通过测定精子质量和精巢结构与功能的变化来探究过量Cu暴露对这一经济物种的生殖毒性，并利用转录组技术进一步揭示其生殖毒性的分子机制。以期从生化水平、分子水平、组织水平、个体水平，来探究Cu污染对这一重要经济物种生殖机能的影响。研究结果如下： (1)环境相关浓度(0.03、0.30、3.00mg/L)Cu2+暴露克氏原鳌虾7d，克氏原鳌虾不同组织中Cu含量的排序为：鳃gt;肝胰腺gt;精巢gt;触角腺gt;肠gt;肌肉，其中鳃和肝胰腺为Cu蓄积的主要组织。而将其转移至清水中恢复7d后，肝胰腺中的过量Cu被完全清除，恢复至对照水平。这部分研究结果表明，克氏原鳌虾肝胰腺具有在短时间内快速蓄积和清除过量Cu的能力。 (2)在0.03、0.30、3.00mg/LCu2+暴露7d后，克氏原鳌虾通过下调肝胰腺中Cu稳态相关基因(Ctr1、Atox1、copper-transportingATPase2、MTF-1/2、MT)的表达水平来抑制Cu在细胞内的转运；通过增加肝胰腺GPx和GST活性、GSH含量、以及抗氧化酶基因(Cu/Zn-sod、cat、gpx、gst)的表达量，来应对过量Cu蓄积诱导的氧化应激。另外，在无Cu的清水中清除7d后，克氏原鳌虾通过上调肝胰腺中Cu稳态基因的表达水平来清除过量的Cu；并通过增强抗氧化酶基因(Cu/Zn-sod、cat、gpx、gst)的表达水平和利用更多的GSH，从氧化损伤中得以恢复，而且丙二醛(MDA)的含量由Cu暴露期的显著升高恢复至对照水平。研究结果表明，在Cu胁迫和去除胁迫后，对肝胰腺抗氧化系统和Cu稳态系统的调控有助于克氏原鳌虾对Cu的解毒和耐受。 (3)0.03和3.00mg/LCu2+暴露雄性克氏原鳌虾7d，能够升高精巢中活性氧(ROS)和MDA含量，诱导氧化损伤，进而导致精子质量降低、精巢组织结构损伤(精细胞的凋亡坏死和支持细胞的空泡化)。为进一步探明Cu诱导克氏原鳌虾精巢氧化损伤的分子机制，本研究利用转录组测序技术对克氏原鳌虾精巢基因进行测序、组装、注释、定量。高浓度(3.00mg/L)Cu2+暴露后，识别了克氏原鳌虾精巢中6,745个差异表达的基因，GO富集分析结果表明其中大部分基因涉及对ROS的响应。进一步，KEGG富集分析结果表明，一些表达水平上调的基因显著富集在氧化磷酸化通路中，这也表明被干扰的线粒体电子传递链可能是Cu诱导ROS的过量产生的一个主要来源。这部分研究首次采用转录组技术探究了Cu对克氏原鳌虾生殖机能的影响，而且识别了Cu生殖毒性分子机制相关的通路，这为Cu对甲壳类的生殖毒性研究提供了新的思路。 综上所述，本研究结果表明克氏原鳌虾肝胰腺具有在短时间内快速蓄积和清除过量Cu的能力。为了应对过量Cu的蓄积及其造成的氧化损伤，克氏原鳌虾能够通过调节肝胰腺中抗氧化系统和Cu稳态系统进行解毒，提高其对过量Cu的耐受性并在短时间内从氧化损伤中恢复。因此，本研究认为克氏原鳌虾抗氧化系统和Cu稳态系统相关指标的变化可作为评估水环境Cu污染水平的潜在的生物标记物。另外，Cu暴露还能够通过干扰氧化磷酸化通路上的基因表达来诱导氧化应激，造成雄性克氏原鳌虾精巢氧化损伤，甚至降低精子质量进而影响这一经济种的生殖力。同时，本文也将为进行克氏原鳌虾高消费人口的重金属膳食暴露评估和健康风险评估提供更多的理论依据。
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