摘要
人角膜基质是厚度约占整个角膜90%的一层致密结缔组织，其胶原板层的排列高度有序可使入射光发生“相消性干扰”、减少光线散射，对于维持角膜高度透明及人眼的正常视觉功能起到至关重要的作用。HCS细胞是角膜基质层中主要的细胞类型，在细胞外基质的分泌和装配进而维持角膜基质层结构的高度有序性，以及角膜基质的创伤修复中发挥有不可替代的关键作用。在受到机械创伤、病原体感染和药物毒害等刺激后，HCS细胞会死亡或发生表型转化，导致角膜出现不同程度的水肿和透明度降低，严重时则角膜发生混浊甚至引起人眼失明。近年来随着眼科药物的广泛使用，眼科药物对HCS细胞的毒性作用及其对角膜透明度和视力健康的危害，越来越引起了临床医师和学者们的高度关注。在众多眼科药物中，盐酸卡替洛尔是眼科临床上经常使用的青光眼治疗药物之一。现已发现，临床使用浓度为20mg/mL盐酸卡替洛尔能引起眼睛刺痛、流泪、结膜充血水肿等不良反应，甚至能引起人角膜上皮细胞发生细胞凋亡，但关于盐酸卡替洛尔对HCS细胞的毒性作用及其作用机理尚未见报道。 本文拟首次以实验室自主建立的非转染/无致瘤性的HCS细胞作为细胞模型、以组织工程人角膜基质为组织模型、以新西兰兔为动物模型，系统研究盐酸卡替洛尔对HCS细胞的毒性作用及其作用机理，旨在评估盐酸卡替洛尔对HCS细胞的毒性作用，并初步阐明其毒性作用的细胞与分子机理，为盐酸卡替洛尔的临床安全用药及其毒性预防策略提供理论指导，同时也为新型无毒眼科药物的研发奠定理论基础。 首先，本文以体外培养的HCS细胞为细胞模型，分别使用倍比稀释的、浓度在0.0390625~20mg/mL的盐酸卡替洛尔溶液处理体外培养的对数期HCS细胞，根据细胞形态、细胞活力和质膜通透性的变化，评估不同浓度盐酸卡替洛尔对HCS细胞的毒性作用。光镜观察结果显示，浓度为0.15625~20mg/mL的盐酸卡替洛尔均能够引起HCS细胞发生不同程度的空泡化、皱缩变圆和脱壁死亡，并具有浓度和时间依赖性；MTT检测结果发现，0.078125~20mg/mL盐酸卡替洛尔能浓度和时间依赖性地引起HCS细胞活力的显著降低；AO/EB荧光双染色结果发现，0.15625~2.5mg/mL盐酸卡替洛尔能浓度和时间依赖性地引起HCS细胞的质膜通透性增大；上述结果表明，盐酸卡替洛尔在浓度高于0.15625mg/mL时，对HCS细胞具有显著的毒性作用，并具有浓度和时间依赖性。 由于细胞活力降低和质膜通透性变化往往与细胞凋亡（Apoptosis）或凋亡性坏死（Necroptosis）有关，且外源药物和毒性物质对细胞的毒性作用，一般是在低浓度下诱导细胞凋亡，而在高浓度下则很可能会诱导凋亡性坏死。因此，为了确定盐酸卡替洛尔对HCS细胞毒性作用是通过诱导细胞发生凋亡还是凋亡性坏死来实现的，本文进而根据细胞周期、磷脂酰丝氨酸（PS）定位、基因组DNA完整性和超微结构的变化，首先鉴定了低浓度盐酸卡替洛尔对HCS细胞的凋亡诱导作用。细胞周期时相的流式细胞术（FCM）检测结果证明，2.5mg/mL盐酸卡替洛尔可以诱导HCS细胞发生S和G2/M期阻滞；AnnexinV/PI荧光染色的FCM检测结果显示，2.5mg/mL盐酸卡替洛尔可导致HCS细胞质膜中的PS发生外翻，并具有时间依赖性；透射电镜观察结果发现，2.5mg/mL盐酸卡替洛尔可引起HCS细胞的超微结构发生紊乱，并出现了空泡化、染色质凝缩和形成凋亡小体等凋亡细胞的典型结构变化；DNA琼脂糖凝胶电泳结果发现，0.625~2.5mg/mL盐酸卡替洛尔均能引起HCS细胞的DNA出现典型的梯状条带，说明DNA发生了断片化。上述结果证明，盐酸卡替洛尔在浓度低于2.5mg/mL时对HCS细胞具有凋亡诱导作用。 为了揭示盐酸卡替洛尔诱导HCS细胞凋亡的分子机理，本文进一步检测了2.5mg/mL盐酸卡替洛尔处理组HCS细胞中Bcl家族蛋白的表达变化、线粒体跨膜电位（MTP）的改变、线粒体凋亡激活蛋白的胞质释放以及胱天蛋白酶（Caspase）家族蛋白的表达变化。免疫印迹（Westernblot）结果显示，盐酸卡替洛尔能引起HCS细胞中促凋亡蛋白Bad和Bax表达的上升，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达的下降，同时还能引起细胞色素c和凋亡相关因子AIF从线粒体释放到细胞质中；JC-1荧光染色的FCM检测结果显示，盐酸卡替洛尔引起了HCS细胞的MTP发生了时间依赖性地崩解；ELISA检测结果证实，盐酸卡替洛尔先后激活了HCS细胞中胱天蛋白酶-8、-9和-3的活性。以上结果表明，盐酸卡替洛尔对HCS细胞的凋亡诱导作用，既涉及到死亡受体介导的外源途径又涉及到依赖于线粒体的内源途径。 为了进一步鉴定高浓度盐酸卡替洛尔能否引起HCS细胞发生凋亡性坏死，本文选用5mg/mL盐酸卡替洛尔对HCS细胞进行了处理，根据染色质凝缩、基因组DNA状态、凋亡性坏死标志蛋白RIPK3（Receptor-interactingprotein3）和MLKL（Mixedlineagekinasedomain-likeprotein）表达以及胱天蛋白酶-2活性的变化，鉴定了高浓度盐酸卡替洛尔对HCS细胞的凋亡性坏死诱导作用。AO/EB荧光双染色显示，5~20mg/mL盐酸卡替洛尔虽然能引起HCS细胞质膜通透性的快速剧烈增大，但HCS细胞的染色质并未发生凝缩；DNA琼脂糖凝胶电泳结果证实，5~20mg/mL盐酸卡替洛尔处理的HCS细胞，其DNA未出现梯状条带，即DNA未发生断片化，而是出现了DNA的弥散性降解；Westernblot的检测结果表明，5mg/mL盐酸卡替洛尔引起HCS细胞对凋亡性坏死标志蛋白RIPK3和MLKL表达量的显著升高；ELISA检测结果发现，5mg/mL盐酸卡替洛尔激活了HCS细胞中胱天蛋白酶-2的活性。说明盐酸卡替洛尔在高浓度（≥5mg/mL）时能引起HCS细胞发生凋亡性坏死，而且很可能是通过肿瘤坏死因子受体1（Tumornecrosisfactorreceptor1,TNFR-1）激活胱天蛋白酶-2进而激活RIPK3和MLKL来实现的。 为了验证在上述体外细胞模型中的研究结果，本文又利用TE-HCS为体外组织模型进一步研究了2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL盐酸卡替洛尔对HCS细胞处理8h的毒性作用及其初步机理。冰冻切片的TUNEL检测结果证明，两种浓度盐酸卡替洛尔处理后，TE-HCS中的基质细胞没有发生DNA断裂；免疫荧光检测结果证实，5mg/mL和10mg/mL两种浓度盐酸卡替洛尔处理TE-HCS的基质细胞中，均出现了RIPK3和MLKL的阳性表达，而Caspase-3为阴性表达。说明高浓度的盐酸卡替洛尔可能引起HCS细胞发生凋亡性坏死；2.5mg/mL盐酸卡替洛尔处理TE-HCS的基质细胞中，RIPK3和MLKL的阴性表达，Caspase-3阳性表达。说明低浓度的盐酸卡替洛尔可能引起HCS细胞发生凋亡。这些体外组织模型的研究结果证实，盐酸卡替洛尔在浓度为5mg/mL和10mg/mL时确能引起HCS细胞发生凋亡性坏死，且很可能是通过TNFR1途径来实现的。 体外细胞模型和体外组织模型的研究结果，虽然能为我们提供出有参考价值的研究结论，但这些结论无法直接用于临床推论，必须要经过动物实验的进一步验证。为了验证体外细胞模型和体外组织模型的研究结论，本文选用新西兰大白兔作为动物模型，根据盐酸卡替洛尔的临床使用浓度（20mg/mL）、用药频次和用药周期，对新西兰兔角膜进行了滴眼处理，在体跟踪检测14天并处死动物进行离体鉴定。在体跟踪检测结果发现，角膜没有出现明显的异常变化，包括角膜透明度、外眼相、角膜厚度无明显变化。处死动物后对角膜进行离体鉴定。对角膜进行冰冻切片和HE染色后，没发现明显的组织结构变化；TUNEL检测结果发现，药物处理组的部分兔角膜基质细胞出现了DNA断裂；超微结构观察结果显示，药物处理组的部分兔角膜基质细胞中，出现了空泡、线粒体肿胀和染色质的轻度凝缩；免疫荧光染色结果表明，药物处理组的部分兔角膜基质细胞中胱天蛋白酶-3、-8和-9都出现了阳性染色，但凋亡性坏死标志蛋白RIPK3和MLKL的表达均为阴性。上述动物实验结果表明，盐酸卡替洛尔对兔角膜基质细胞具有显著的毒性作用，是通过诱导细胞凋亡而不是凋亡性坏死来实现的，且对细胞凋亡的诱发既依赖于死亡受体的外源途径又依赖于线粒体的内源途径；此外，本文所取得的动物实验结果与体外细胞模型及体外组织模型的显著不同，充分证明了体外模型与动物模型的差别，因此，在利用体外实验结果得出临床推论时需要十分谨慎。 综上所述，本文首次利用体外HCS细胞模型、体外TE-HCS组织模型和体内新西兰兔动物模型，系统研究了盐酸卡替洛尔对HCS细胞的毒性作用及其作用机理，发现盐酸卡替洛尔在体外对HCS细胞的毒性作用要大于体内，体外低浓度（≤2.5mg/mL）能诱导HCS细胞发生凋亡、体外高浓度（≥5mg/mL）却能诱导HCS细胞发生凋亡性坏死，而在体内临床浓度下也只能诱导HCS细胞发生凋亡，且盐酸卡替洛尔的凋亡诱导作用是通过死亡受体介导的外源途径和依赖于线粒体的内源途径激活的，但其凋亡性坏死的诱导作用则是通过TNFR1受体实现的。本文关于盐酸卡替洛尔对HCS细胞毒性作用及其细胞与分子机理的研究结果，为进一步认识盐酸卡替洛尔这个抗青光眼药物的体内外毒性作用提供了依据，对于盐酸卡替洛尔的眼科临床安全用药及其细胞毒性的前瞻性干预治疗具有重要的科学参考价值，同时也为新型无毒抗青光眼药物的开发奠定理论基础。
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