摘要
扩展青霉（Penicilliumexpansum）是一种常见的采后病原真菌，能够侵染多种果蔬并引发青霉病，造成重大经济损失和资源浪费，严重制约农产品产业的发展。当前控制P.expansum的手段主要为化学方法，但化学杀菌剂残留容易造成环境污染、人体毒害等诸多问题，促使安全、高效、环保的新型防治方法备受食品领域关注。光动力技术是近年发展起来的一种新型非热杀菌技术，已被报道可有效杀灭多种病毒、细菌、酵母、丝状真菌和原生动物，并且能够很好地保持果蔬感官和营养品质，在果蔬领域发展前景广阔。姜黄素是一种药食同源的天然光敏剂，其介导的光动力技术对多种霉菌具有良好的杀菌效果。本研究探究以姜黄素为光敏剂的光动力技术对P.expansum离体、活体条件下的杀菌效果，并从形态结构、氧化胁迫、细胞凋亡三个角度，分析该技术的离体杀菌作用机理，为该技术在果蔬领域的进一步应用提供理论基础和科学依据。 本研究首先筛选获得光动力技术的最佳杀菌条件，并研究了该技术对P.expansum离体、活体条件下生长情况的抑制效应。姜黄素浓度和光照时间是光动力技术的主要条件，研究发现延长光照时间可以显著提高杀菌效果，而较高浓度的姜黄素并不能降低P.expansum孢子存活率。综合分析得到最优杀菌条件为100μmolL-1姜黄素、30min光照（以30minP+表示），此条件下可以杀灭99.7%的孢子。进一步探究发现，离体条件下光动力处理可以有效抑制P.expansum孢子的萌发和菌丝在液体/固体培养基中的扩展，且抑制效果随光照时间延长而增强，30minP+处理后，孢子萌发率仅为1.3%，液体培养基中没有明显菌丝生长，5天内固体培养基中菌丝扩展抑制率大于68%。接种P.expansum的金冠苹果经光动力处理后贮藏7天，30minP+处理可减小66.7%的苹果病斑直径，而60minP+可减小97.6%。因此，光动力技术在离体和活体条件下均可以有效杀灭P.expansum，在食品领域具有实际应用的可行性。 其次，从形态结构角度对光动力技术杀灭P.expansum的机理进行探究。流式细胞仪、扫描电镜和透射电镜检测发现长时间的光动力处理造成P.expansum孢子体积缩小、外部细胞壁皱缩和内部细胞超微结构破坏。FluorescentBrighter28和碘化丙啶荧光染色结果表明P.expansum细胞壁最主要成分几丁质的含量和分布无显著变化，但细胞膜损伤严重，是光动力技术的重要靶标部位。 再次，从氧化胁迫角度对光动力技术杀灭P.expansum的机理进行探究。DCFH-DA染色结果显示光动力处理提高了细胞内活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平。丙二醛和羰基含量检测结果表明长时间光照引起P.expansum脂质和蛋白质氧化，造成氧化胁迫。检测P.expansum的酶/非酶抗氧化防御系统发现，短时间光照使超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）酶活力升高，长时间光照提高了谷胱甘肽过氧化物酶（glutathionperoxidase,GPx）酶活力并促进还原型谷胱甘肽（reducedglutathione,GSH）向氧化型谷胱甘肽（oxidizedglutathione,GSSG）转化，过氧化氢酶（catalase,CAT）则在光动力处理过程中始终保持低酶活力。由此表明，光动力处理促进ROS的产生和积累，进而诱发P.expansum抗氧化防御系统产生响应：短时间光动力处理下，P.expansum主要依靠SOD有效抵御ROS氧化损伤；长时间光动力处理下，GPx和GSH发挥更主要的作用，但ROS水平超过防御系统负荷，导致细胞内氧化胁迫，最终造成菌体死亡。 最后，通过细胞凋亡检测解析光动力技术诱导P.expansum的细胞死亡方式。短时间光照下，P.expansum出现了磷脂酰丝氨酸外翻和细胞核浓缩的凋亡特征。进一步研究发现光动力处理诱导细胞内ROS和Ca2+水平的提高，导致线粒体膜电位丧失，从而促进了细胞色素c从受损的线粒体向细胞质中释放，激活下游Caspase3，最终发生程序性细胞凋亡。长时间光照下，光动力处理严重损伤P.expansum细胞膜，导致细胞坏死。由此可见，光动力技术通过短/长光照时间以诱导凋亡和坏死两种模式实现对P.expansum的杀菌作用。 综上所述，光动力技术能够在离体和活体条件下有效杀灭P.expansum，其中短时间光动力处理通过诱导细胞凋亡杀死P.expansum，而长时间光动力处理则造成氧化胁迫，严重破坏P.expansum的细胞膜和内部结构，造成细胞坏死。本论文的研究结果为开发一种绿色高效的果蔬采后病害防治方法提供了新的视角和思路。
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