摘要
将白鲢掺入其他海水鱼中作为鱼肉制品的原料已是行业常态，但是加工企业在验收鱼糜原料时不能得知白鲢的准确含量，这导致接下来的生产难以进行精准的质量控制。目前还没有有效的方法对混合鱼肉中白鲢的含量进行检测，这严重损害了鱼肉制品加工企业的利益和消费者的知情权。针对上述问题，本研究选取可能掺杂白鲢鱼糜的6种海水鱼作为对照，包括鲅鱼、带鱼、卵形鲳鲹、小黄鱼、狭鳕和铜盆鱼；以物种特异性高、热稳定性强的鱼类过敏原蛋白——小清蛋白为研究对象，建立了两种混合鱼肉中白鲢成分的检测方法。通过高分辨质谱结合NCBI数据库氨基酸序列比对工具筛选白鲢的检测标识肽，建立了基于蛋白质谱技术的白鲢成分检测方法；通过大量PCR实验筛选白鲢的特异性引物，建立了基于荧光定量PCR技术的白鲢成分检测方法。通过比较这两种方法的适用范围，选择出更为合适的技术手段，为鱼肉制品原料中白鲢成分的鉴定提供理论依据和技术支持，实现对海水鱼原料掺杂白鲢的行业现象的有效监管和控制，保障企业和消费者利益，并为其他鱼种鉴别的研究提供思路借鉴。主要的研究内容如下:1.基于蛋白质谱技术建立白鲢鱼肉成分检测方法 选择小清蛋白作为白鲢鱼种鉴定的特征蛋白，通过高分辨质谱分析酶解样品，筛选出了白鲢的检测标识肽（IGVDEFAVLVK和AFAIIDQDK）。建立了两个检测标识肽的多反应监测技术（MRM）检测方法，并对酶/蛋白质比例、酶解时间等前处理条件进行了优化。采用了双肽段（IGVDEFAVLVK和AFAIIDQDK）定性，以提高定性结果的准确性，并以其中的IGVDEFAVLVK为定量肽段，建立了混合鱼肉中白鲢成分的质谱检测方法，实现了对上述6种鱼中白鲢含量的定性定量分析。方法的线性关系良好（R2gt;0.95），回收率在99.3%-129.2%之间，相对标准偏差（RSD）小于5%，重复性好，满足检测要求。 2.基于荧光定量PCR技术建立白鲢鱼肉成分检测方法 通过对NCBI数据库中小清蛋白DNA序列比对以及PCR实验，发现了一段物种特异性强的白鲢小清蛋白内含子序列，根据此序列设计并筛选出白鲢的特异性引物0823-2，基于其PCR产物的高物种特异性，建立了混合鱼肉中白鲢成分的荧光定量PCR检测方法，实现了对上述6种鱼中白鲢成分的定性和定量分析。方法的线性关系良好（R2gt;0.99），回收率在93.6%-97.8%之间，相对标准偏差（RSD）小于5%，重复性好，满足检测要求。 3.蛋白质谱与荧光定量PCR检测方法的比较分析 本研究建立的两种检测方法具有较高的灵敏度（LOD≥0.5g/kg）和较好的稳定性（RSD＜5%），可以满足混合鱼肉中白鲢成分的定性定量分析的要求，其中荧光定量PCR检测方法的准确度更高。SDS-PAGE分析结果证明蛋白质谱检测方法不适用于漂洗过的鱼肉原料；而白鲢特异性引物0823-2在漂洗过的样品中的扩增效率为96.9%，说明荧光定量PCR检测方法可以用于检测漂洗过的鱼肉原料。另外，蛋白质谱方法的操作耗时为15h，而荧光定量PCR方法的操作耗时为4h，所以采用荧光定量PCR能够有效降低时间成本和设备成本。因此荧光定量PCR方法可以作为定性定量检测白鲢成分的常规手段，用于企业收购原料、质量控制和产品监管过程中。
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