摘要
系列研究证据显示长期高果糖饮食在增加肥胖症、非酒精性脂肪肝等代谢疾病的风险同时，对中枢神经系统也可能产生有害效应。本课题组前期研究已观察到高果糖饮食小鼠中枢海马区神经炎症和神经元丢失，但其中机制尚需进一步阐明。 肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤是引起中枢神经炎症的重要环节。高果糖饮食可引起实验动物肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤，但这一过程是否促进海马区神经炎症和神经元丢失，目前还缺乏相关的研究证据。NOD样受体蛋白6(NLRP6)是在肠道高表达的NOD样受体(NLR)家族成员之一，NLRP6与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱天冬氨酸特异性蛋白酶l(Caspase-1)共同组成NLRP6炎症小体，能够将白介素-1β(IL-1β)和IL-18前体分别剪切成具有活性的IL-1β和IL-18。NLRP6炎症小体具有维持肠道菌群平衡和保护肠道屏障功能等作用，其缺失则导致实验动物肠道菌群紊乱、结肠炎性细胞浸润以及结肠杯状细胞的黏液分泌功能受损等。那么，高果糖饮食是否抑制肠道NLRP6炎症小体的激活而导致肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤？另一方面，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂可上调NLRP6炎症小体表达，肠道菌群代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)作为肠道细胞重要的能量来源以维持肠道菌群平衡和肠道屏障功能，并激活PPARγ，但SCFAs能否通过激活肠道NLRP6炎症小体，改善肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤，而抑制高果糖饮食小鼠海马区神经炎症和减少神经元丢失？ 中药桑白皮主要成分桑皮苷A(mulberroside A)和白藜芦醇(resveratrol)均为二苯乙烯类化合物，具有抗氧化和中枢神经保护作用，后者能降低肠道氧化应激而保护肠道屏障。已知氧化应激可促进肠道屏障损伤，由此，研究桑皮苷A和白藜芦醇能否改善肠道菌群紊乱和肠道屏障氧化应激损伤而减轻高果糖饮食引起海马区神经炎症甚为重要。 本文首先观察高果糖饮食对小鼠肠道菌群和肠道屏障的影响。与正常组比较，高果糖模型组动物粪便菌群结构出现了明显差异，如拟杆菌门(Bacteroidetes)数量显著减少、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)数量显著增加，其中有害菌群Mucispirillum和Helicobacter等数量也显著增加，而粪便中短链脂肪酸水平却显著降低;而肠道也出现了明显的组织病理学改变和上皮细胞超微结构损伤，结肠紧密连接相关蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)和黏液相关蛋白黏蛋白2(Muc2)表达显著降低，结肠NLRP6炎症小体的激活受到抑制;与此同时，该果糖模型小鼠血清内毒素(endotoxin)水平显著增加。并进一步明确高果糖饮食模型动物海马区肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6水平显著增加、小胶质细胞和星形胶质细胞数量显著增加、齿状回(DG)区神经元数量和新生神经元数量显著减少等。 为探索高果糖饮食所引起的海马区神经炎症和神经元丢失与肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤之间的关联，本文采用广谱抗生素处理实验动物。与果糖模型组比较，经抗生素处理后的高果糖饮食小鼠，其粪便菌群结构如种类和数量显著降低，肠道上皮细胞的超微结构恢复正常，血清内毒素水平也显著降低，但常规肠道组织病理以及结肠ZO-1、occludin和Muc2表达水平、NLRP6炎症小体激活水平等则无明显差异。与此同时，抗生素可显著降低高果糖饮食模型小鼠海马区TNF-α、IL-1β和IL-6水平，减少小胶质细胞和星形胶质细胞的数量，但并未显著改善其DG区神经元数量和新生神经元数量的减少。这些实验结果提示，高果糖饮食所引起的肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤可能促使血清内毒素水平的增加，这是导致海马区神经炎症的重要环节。 基于上述，本文进一步探究短链脂肪酸和PPARγ激动剂吡格列酮能否通过激活肠道NLRP6炎症小体，改善肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤，从而抑制高果糖饮食小鼠海马区神经炎症和减少神经元丢失。与果糖模型组比较，短链脂肪酸和吡格列酮均能重塑粪便菌群结构，如显著增加拟杆菌门数量、降低有害菌Mucispirillum数量等，改善肠道组织病理和上皮细胞超微结构损伤，上调结肠ZO-1、occludin和Muc2表达水平，降低血清内毒素水平。同时，它们还显著降低该模型动物海马区TNF-α、IL-1β和IL-6水平，减少小胶质细胞数量，增加DG区神经元和新生神经元数量。值得关注的是，短链脂肪酸能激活高果糖饮食小鼠结肠NLRP6炎症小体，这一结果在体外结肠外植体和Caco-2细胞实验中获得验证;而吡格列酮虽然也能激活模型动物结肠NLRP6炎症小体，但在体外实验中未显示出其对NLRP6炎症小体的直接作用。 再者，本文研究发现桑皮苷A和白藜芦醇可改善高果糖饮食小鼠肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤，并抑制海马区神经炎症。经桑皮苷A和白藜芦醇干预后，高果糖饮食小鼠粪便菌群中有害菌Mucispirillum和Helicobacter数量显著降低、粪便短链脂肪酸水平显著增加、肠道组织病理和上皮细胞超微结构损伤也得到改善、结肠NLRP6炎症小体激活、ZO-1、occludin和Muc2表达水平显著增加、血清内毒素及海马区TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低。另外，桑皮苷A和白藜芦醇可显著增加高果糖饮食小鼠结肠抗氧化酶过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)表达水平、以及细胞核内的核因子E2相关因子2(Nrf2)水平，显著降低结肠过氧化物丙二醛(MDA)水平。另外，本文发现桑皮苷A和白藜芦醇显著逆转过氧化氢所引起的Caco-2细胞ROS水平升高，ZO-1和occludin表达降低，初步验证了桑皮苷A和白藜芦醇能减轻氧化应激对肠道屏障的损伤作用。 本文小结:研究结果表明，高果糖饮食可能通过其引起肠道菌群紊乱，造成肠道菌代谢产物短链脂肪酸减少和氧化应激，抑制结肠NLRP6炎症小体的激活使肠道屏障损伤，进而促使进入血液的内毒素增加，造成中枢海马区神经炎症和神经元丢失的发生。补充短链脂肪酸可恢复肠道菌群结构，激活结肠NLRP6炎症小体，改善肠道屏障损伤，降低血液内毒素水平，从而抑制高果糖饮食所引起的海马区神经炎症和减少神经元丢失。抗氧化剂桑皮苷A和白藜芦醇能恢复肠道菌群结构，促进肠道菌群产生短链脂肪酸而激活NLRP6炎症小体，并降低氧化应激改善肠道屏障损伤，从而降低血液内毒素水平，抑制海马区神经炎症。本文研究揭示了高果糖饮食诱导肠道菌群紊乱和肠道屏障损伤促进海马区神经炎症和神经元丢失的新机制，阐明了NLRP6炎症小体在维持肠道菌群平衡和保护肠道屏障所起的重要作用，以及氧化应激对肠道屏障的损害效应。本文研究也提示通过补充短链脂肪酸、桑皮苷A和白藜芦醇以激活肠道NLRP6炎症小体，或可成为改善高果糖饮食所造成的肠道菌群紊乱、肠道屏障损伤、海马区神经炎症和神经元丢失的重要预防和治疗措施。 短链脂肪酸和桑皮苷A改善肠道菌群紊乱与屏障损伤而抑制高果糖饮食小鼠海马区神经炎症的作用示意图。
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