摘要
低温是影响茶树生长和繁殖的重要因素，冬季的极端低温和初春的“霜冻”或“倒春寒”常常造成茶树的低温伤害，影响茶叶品质，制约茶产业的发展。茶树在冷驯化过程中，不仅体内生理和生化过程发生变化，而且许多受低温调节的特异蛋白和mRNAs也被诱导表达。研究与了解茶树低温胁迫下的耐寒机制，有针对性地发掘相关耐寒基因并加以利用，是近年来茶树栽培育种研究领域中的一个热点。本研究对低温胁迫下的云雾贡茶进行生理生化指标测定，找出胁迫的临界温度、临界时间，从生理角度探讨云雾贡茶防御低温伤害的机理；基于Illumina平台进行转录组测序，分析低温胁迫下云雾贡茶耐寒相关基因的表达模式及其与响应生理指标之间的相关性；通过转基因技术对茶树多酚氧化酶基因（CsPPO）进行功能鉴定，研究多酚氧化酶基因在茶树耐寒中的作用。研究茶树的耐寒性，对茶树的种质资源的利用、引种、耐寒育种及茶树耐寒栽培技术的提高都有十分重要的理论和实践意义。主要研究结果如下： 1.云雾贡茶对低温胁迫的生理响应 在低温胁迫下，云雾贡茶电导率和丙二醛（MDA）含量随着胁迫时间的延长呈上升趋势，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、多酚氧化酶（PPO）活性及渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白）含量随着胁迫时间的延长呈先上升后下降趋势，最高值基本出现在1℃胁迫下处理第3d。低温胁迫初期云雾贡茶能通过自身调节机制适应胁迫，减轻低温引起的伤害，随着胁迫时间的延长，抗氧化酶和渗透调节物质对膜系统的保护作用及调节机制超过一定限度，就会造成代谢失调，引起不可逆的损伤。在低温（1和4℃）胁迫下，云雾贡茶脱落酸（ABA）含量显著高于对照，吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）含量显著低于对照，随胁迫时间延长，ABA、IAA含量呈先上升后下降的趋势，GA含量呈下降趋势。低温胁迫下，云雾贡茶能提高ABA生长抑制类物质，降低IAA、GA生长促进类物质，通过调节植物体内内源激素平衡来应对低温。 2.低温胁迫下云雾贡茶转录组分析 以1℃低温处理3d为胁迫温度和时间，使用IlluminaHiSeq平台对云雾贡茶低温组（DW）和对照组（CK）进行转录组测序，共获得约38.69Gb数据，拼接成185,973个unigenes，平均长度992bp，功能注释约61%。这些unigenes在低温胁迫下主要富集于代谢通路（Metabolicpathways）和次生代谢产物的生物合成（Biosynthesisofsecondarymetabolites）。选取与前期生理指标相关的谷胱甘肽代谢通路、脯氨酸代谢通路、酪氨酸代谢通路、类胡萝卜素生物合成通路和双萜类生物合成通路分析发现，在低温胁迫下，共有789个差异表达显著的unigenes，其中366个unigenes上调表达，423个unigenes下调表达。 3.耐寒相关基因的表达水平与其响应生理指标的相关性 分析与前期生理指标相关的代谢通路中差异倍数较大的5个耐寒相关基因，谷胱甘肽氧化物酶（GPX）、多酚氧化酶（PPO）、吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、9-顺式环氧双加氧酶（NCED）和赤霉素3β双加氧酶（GA3OX）的表达模式经qRT-PCR和RNA-Seq检测结果一致。在低温胁迫下，GPX、P5CS、NCED均显著上调表达，随着胁迫时间的延长，基因表达水平均呈现先上升后下降的趋势，其峰值分别为对照的2.6倍、2.4倍和4.8倍。而PPO和GA3OX均显著下调表达，随着胁迫时间的延长，PPO表达水平呈现先下降后上升的趋势，在1℃胁迫处理3d时，仅为对照的11.1%；GA3OX表达水平无明显变化。在低温胁迫下，云雾贡茶GPX、PPO、P5CS、GA3OX和NCED的表达水平分别与POD活性、PPO活性、Pro含量、GA含量和ABA含量呈极显著性正相关，表明这些基因在调控其响应生理指标活性中起重要作用。 4.云雾贡茶CsPPO基因的克隆及功能鉴定 克隆云雾贡茶的多酚氧化酶基因CsPPO，序列全长1740bp，编码580个氨基酸，与茶树(Camelliasinensis)植物的多酚氧化酶基因同源性为96.72%。构建CsPPO过表达载体，通过农杆菌转化到烟草中得到超量表达，在4℃低温胁迫的条件下，CsPPO表达水平呈现先上升后下降的趋势，在胁迫处理第5d的时候达到最高，是对照组（野生型）的3倍。对转基因烟草耐寒的生理特性分析，在低温胁迫下，从表型上来看转基因烟草耐寒性大于野生型烟草，转基因烟草的相对电导率和MDA含量显著低于野生型烟草而PPO活性显著高于野生型烟草。说明转基因烟草能明显地减轻细胞膜的受损程度，抑制细胞膜脂质氧化作用，提高多酚氧化酶活性，从而显著提高了转基因烟草在低温环境中的耐寒性。
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