摘要
胆管癌是一种来源于胆管上皮细胞的肝内第二大常见肿瘤，约占所有肝胆恶性肿瘤的10%–15%。由于缺乏有效的非手术治疗途径和早期临床诊断标志物，胆管癌患者预后差，5年总体生存率不足5%，术后中位生存时间仅为3年。随着精准医疗概念逐渐兴起，合成致死疗法的研究得以快速发展并取得了临床治疗上的成功，其原理是：通过抑制两个非致死基因同时失活而最终导致肿瘤细胞死亡。 得益于下一代测序技术的发展，在不同类型的癌症中分别鉴定出了大量的基因突变。ARID1A作为编码SWI/SNF复合物亚基BAF250a的基因，在胆管癌中的突变频率高达20%。在本研究中，我们利用生物信息学方法筛选到与ARID1A配对的潜在合成致死基因乙醛脱氢酶2（ALDH2），为了验证胆管癌中ARID1A与乙醛脱氢酶2的合成致死效应，我们利用CRISPR/Cas9技术构建了HCCC9810和HuCCT1两个ARID1A敲除的胆管癌稳转细胞株。在细胞克隆形成实验中，我们采用高效、廉价、易获取的乙醛脱氢酶2抑制剂双硫仑(Disulfiram，DSF)在ARID1A野生型和敲除型的胆管癌细胞水平上验证了合成致死表型；为了探究合成致死的分子机制，我们利用流式细胞技术检测到ARID1A基因敲除后胆管癌细胞中活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）含量增加，乙醛脱氢酶2抑制剂联合处理后胆管癌细胞中的ROS含量进一步累积，根据这一现象提出ROS是导致DSF与ARID1A敲除共处理后胆管癌细胞死亡原因的假设。为了验证提出的假设，我们利用ELISA实验、流式细胞技术证明了ROS一方面直接引起ARID1A敲除型胆管癌细胞发生DNA损伤进而诱导细胞凋亡，另一方面Westernblot实验结果显示ARID1A敲除型胆管癌细胞中ROS激活了ASK1信号通路，通过线粒体途径激活凋亡执行蛋白Caspase3和PARP1进而诱导细胞凋亡。 本研究从生物信息学分析出发，筛选出胆管癌细胞中具合成致死效应的基因组合ARID1A/ALDH2，通过构建胆管癌稳转敲除细胞株，在细胞水平上从氧化应激和DNA损伤角度阐明ARID1A/ALDH2基因对诱导胆管癌细胞死亡的分子机制，为携带ARID1A失活突变的癌症患者提供治疗策略，为胆管癌的精准治疗提供理论依据和应用实践。
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