摘要
槲皮素是一类具有多种生理功能的黄酮类化合物，多以苷的形式广泛分布于许多植物的花、叶和果实中，如:芦丁、金丝桃苷、槲皮素苷。研究表明，槲皮素有多种药理作用，如抗氧化、抗癌、抗炎症及抗病毒作用，在医学领域表现出极大的应用潜能。但由于大部分黄酮类化合物溶解性差，几乎不溶于水，现代工业上常用碱溶酸沉淀法提取芦丁随后利用无机酸将其水解为槲皮素，操作复杂，能耗高，产率低，选择性不高且所用试剂大多为有机溶剂和酸碱试剂，毒性大不环保，因而急需开发一种绿色高效的槲皮素制备方法。天然低共熔溶剂(Natural eutectic solvents，NADESs)，是一类新型的物化性质可调节的绿色溶剂，可由其组分混合后经加热或冻干制备。NADESs制备材料来源广泛、制备简单、无多余能耗、对环境友好且可生物降解。NADESs的溶剂特性可由简单的调整其组分及比例实现。因其独特的物化特性，NADESs被广泛研究应用于电化学、分离过程及反应过程、医药及食品工业当中。本文利用NADESs从槐米中提取芦丁，并经发芽苦荞中提取的芦丁降解酶(rutin degrading enzyme，RDE)催化得到天然活性产物槲皮素，实现提取和转化两个过程在一个体系内完成。随后为提高转化效率，制备槲皮素的微生物全细胞催化剂，从发霉苦荞中驯化得到一株具有RDE活性的菌株，经鉴定为一株镰刀菌(Fusarium spp.)，将其应用于全细胞催化，提高催化效率。最后对微生物中得到的RDE进行无载体固定化制备芦丁降解酶聚集体(cross-linked enzyme aggregate，CLEA)，通过固定化提高其热稳定性及机械稳定性，具体内容如下: 1、利用NADESs酶法制备槲皮素方法研究。本实验制备了11种NADESs并对其理化性质进行了研究，而后以它们作为萃取介质从槐米中提取芦丁，从发芽苦荞中提取RDE水解芦丁制备槲皮素。NADESs中芦丁溶解度的测定结果表明，大部分NADESs对芦丁有很好的溶解性，与在水中相比溶解度提高了67～3116倍。不同NADESs种类萃取率差异明显，其中甘油与氯化胆碱以1∶1的摩尔比例合成的NADESs(ChGly)萃取率最高，优化萃取条件后可达291.57mg/g。随后在萃取体系中直接酶解，在最优条件(于1mL芦丁浓度为1mg/mL80％ChGly-水共溶剂中，加入55μL粗酶液，35℃下反应15min)下芦丁转化速率可达8.36mg·min-1·L-1。对RDE的酶学特性研究得该酶分子大小在60kD左右，最适pH为5.0，最适温度为50℃;不同无机金属离子种类和浓度对该酶都有一定抑制作用，但抑制作用大小不同;利用双倒数作图法得到芦丁降解酶Km和Vmax值分别为1.6mmol/L和15mmol/L。经实验验证该制备方法简便可行、高效环保，为槲皮素的制备提供了一种可行的新方法。 2、槲皮素的微生物全细胞催化制备研究。采用察氏培养基驯化发霉苦荞中的微生物，逐渐提高芦丁占比直至其作为全部碳源，将此时得到的微生物进行分离纯化，得到的菌株在芦丁作为唯一碳源的液体察氏培养基中测定RDE活性，驯化分离得到一株细菌和一株霉菌，活力鉴定得到霉菌RDE体系转化率为53.92％高于细菌体系转化率2.43％，随后对该霉菌进行生态学鉴定和生化鉴定，菌落观察及显微镜观察初步鉴定其为一株镰刀菌，经DNA提取，PCR扩增后，0.8％琼脂糖凝胶电泳得到一条单一条带，分子大小在600bp左右，与NCBI中已收录的ITS rDNA序列进行比对，选择同源相似性在95％以上的菌株构建系统发育树得到该霉菌为一株镰刀菌(Fusarium spp.)。将其制备为全细胞催化剂，优化水解条件得到最优反应体系为:全细胞催化剂添加量为6μL，反应时间36h，NADESs百分比为40％。在最优条件下进行三次验证实验得到芦丁降解速率为369.54μg·min-1·L-1。 3、CLEA-RDE的制备、酶学特性及催化应用研究。本章实验利用交联酶聚集体法固定化RDE，优化固定化条件为初步纯化后的RDE液稀释20倍，取4.5mL加入0.1μg BSA，室温静置30min后加入25％戊二醛溶液至终浓度为0.25％，调pH为6，4℃下缓慢搅拌交联3h。随后离心取沉淀，洗涤溶解即可得到CLEA-RDE。优化后芦丁降解速率为8.16mg·min-1·L-1。随后对CLEA-RDE的结构进行表征，红外色谱、扫描电镜和紫外扫描的结果验证了CLEA-RDE的形成是由于戊二醛的交联作用。由于固定化前后酶分子结构形态发生变化，重新优化催化条件得到最优反应体系:pH为5，反应时间15min，反应温度为40℃在最优条件下得到芦丁降解速率为10.65mg·min-1·L-1。CLEA-RDE酶学特性研究表明，固定化前后酶的最适温度没有发生太大变化，最适pH向碱的方向移动。温度稳定性及酸碱稳定性均有提高，对有机试剂的耐受性实验得到RDE交联前后，其耐受性都随有机试剂疏水性的增加而增加，而CLEA-RDE在疏水环境下耐受性与游离芦丁降解酶(free-RDE)相比提高更多（如在乙醇中，CLEA-RDE的残余活性几乎为free-RDE的两倍）。反应动力学研究表明与free-RDE(Km=0.00232mol/L,Vmax=0.00695mol/L)相比，CLEA-RDE(Km=0.034mol/L,Vmax=0.0037mol/L)，Km值增大，与底物亲和力下降，可能是由于交联酶聚集体活性中心被覆盖，与底物结合受到阻碍。 本实验利用NADESs和RDE建立了一种绿色高效的槲皮素制备方法，结合全细胞催化和无载体固定化研究拓展了催化剂来源并提高了RDE稳定性，为生物活性分子的绿色高效制备提供了新思路。
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