摘要
组织蛋白酶B(cathepsinB，CTSB)是溶酶体蛋白酶家族的成员，参与哺乳动物卵母细胞成熟并影响后续胚胎发育能力。颗粒细胞则是卵泡重要组成部分，对于卵泡发育和卵母细胞成熟起到调控作用。本试验为探究CTSB对绵羊颗粒细胞功能的影响及其作用机制，构建CTSB过表达载体质粒pcDNA3.1-TSB和抑制CTSB表达的siRNA，并转染体外培养的绵羊颗粒细胞作为试验组(CTSB过表达组、CTSB表达抑制组)，并设空白组和阴性对照组，采用CCK8方法检测颗粒细胞的增殖、Annexinv-FITC/PI法检测颗粒细胞凋亡及细胞周期，并利用qRT-PCR检测CTSB信号通路相关基因的表达水平，系统分析CTSB对绵羊卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡、细胞周期及其相关基因的影响，试验结果如下: 通过扩增CTSB基因的CDS编码区，构建含有EcoRI+NheI双酶切位点的CTSB过表达载体(pcDNA3.1-CTSB)，并合成干扰CTSB基因的RNA(siCTSB)。用荧光定量PCR和WesternBlot方法检测CTSB过表达和干扰效率，结果显示:pcDNA3.1-CTSB显著提高CTSB的表达，而siCTSB显著降低CTSB的表达，表明CTSB过表达载体质粒pcDNA3.1-CTSB和抑制CTSB表达的siRNA构建成功。 CCK8方法检测pcDNA3.1-CTSB和siRNA转染颗粒细胞24h后的细胞增殖情况，结果表明:CTSB过表达组极显著抑制颗粒细胞增殖(P＜0.01)，而CTSB表达抑制组极显著促进颗粒细胞增殖(P＜O.01)。 采用Annexinv-FITC/PI双染法检测颗粒细胞转染24h的细胞凋亡情况，结果显示:CTSB过表达组颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P＜0.01)，检测凋亡相关基因mRNA表达水平发现:过表达CTSB极显著上调了Bax、Caspase3凋亡基因的表达(P＜O.01)，显著上调了凋亡基因p53表达(P＜0.05)，Bcl-2基因表达差异不显著(P＞O.05);干扰抑制CTSB基因表达能够极显著降低颗粒细胞的凋亡(P＜0.01)，同时极显著上调Bcl-2基因表达(P＜O.01)，显著下调Bax、p53的表达(P＜0.05)，Caspase3凋亡基因表达量差异不显著(P＞0.05)。 采用流式细胞仪检测转染24h后的细胞周期结果显示:CTSB过表达使颗粒细胞处于G0/GI期细胞比例极显著升高(P＜O.01)，处于S期和G2/M期的细胞比例极显著降低(P＜0.01)，并极显著上调细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、p21的mRNA表达量(P＜0.01);干扰抑制CTSB基因表达使G0/GI期细胞比例极显著下降(P＜0.01)，S期细胞比例极显著上升(P＜0.01)，G2/M期细胞比例与对照组无显著差异(P＞0.05)，同时使细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1的mRNA表达量极显著下调(P＜0.01)，细胞周期抑制因子p21的mRNA表达量显著上调(P＜0.05)。 综上所述，CTSB通过影响CyclinB1、CyclinD1、p21基因的表达负向调控颗粒细胞增殖和细胞周期进程:通过影响Bax、p53等基因表达正向调控颗粒细胞凋亡。可为深入探究CTSB基因调控绵羊卵泡发育提供理论依据。
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