摘要
背景:结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtubeculosis，Mtb）感染而引起的一种人畜共患传染病，巨噬细胞作为抵抗Mtb感染的重要屏障，也是Mtb的宿主细胞，与Mtb相互作用非常复杂。巨噬细胞被Mtb感染后，能够引发自身的凋亡从而使Mtb被临近巨噬细胞吞噬，从而限制Mtb的增殖扩散。但目前的研究表明，因受到多种因素的调控，Mtb已经适应了恶劣的细胞内环境，这使得它能够在这些吞噬细胞内生存和复制，从而逃避了宿主的先天性和适应性免疫反应。而鸟苷酸结合蛋白（guanylatebindingproteins，GBPs）是巨噬细胞中多种形式细胞死亡的上游调节因子，在抵抗病原微生物、抑制肿瘤形成等疾病中发挥着重要作用。但关于Mtb感染巨噬细胞过程中GBP1的作用研究尚未见报道，因此探讨GBP1在巨噬细胞抵抗Mtb感染过程中对巨噬细胞凋亡的调控作用具有积极作用。 目的、方法与结果:本试验以小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)为研究对象，通过牛分枝杆菌卡介苗(BacillusCalmetteGuerin，BCG)感染，利用小干扰RNA降低细胞内GBP1的表达，进而通过westernblotting、流式细胞术、Real-TimePCR、免疫荧光、透射电子显微镜观察等方法，探讨GBP1在BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7过程中对细胞凋亡的调控作用，并探讨其具体机制。取得了如下研究结果: (1)BCG感染极显著上调了巨噬细胞凋亡相关因子Caspase3和PARP1的表达（P＜0.001），并显著增加了小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞凋亡率，且呈明显的时间依赖性;BCG感染巨噬细胞还能够引起鸟苷酸结合蛋白家族GBP1、GBP2、GBP5的高表达(P＜0.001)。 (2)设计并合成了GBP1小干扰RNA，能成功降低GBP1的表达量。和BCG共感染后，仍能够极显著下调BCG感染的巨噬细胞中GBP1的表达量(P＜0.01）。 (3)在BCC感染过程中，敲减GBP1后能够极显著下调巨噬细胞凋亡相关因子Caspase3和PARP1的表达(P＜0.01)，并极显著降低了巨噬细胞凋亡率（P＜0.01）;进一步研究发现，敲减GBP1能够降低BCG感染的巨噬细胞中内源性凋亡通路促凋亡蛋白Caspase9、BAX、CytoC的表达(P＜0.01)，上调抑凋亡蛋白BCL-2的表达（P＜0.01），进一步检测还发现线粒体膜电位降低(P＜0.01)，这更进一步说明敲减GBP1对内源性凋亡产生影响。 (4)BCG感染巨噬细胞能够上调巨噬细胞内ROS含量的积累（P＜0.001），但敲减GBP1后却缓解了这一现象(P＜0.05）。 (5)敲减GBP1后，还下调了BCG感染的巨噬细胞中p-JNK和p-P38MAPK的表达(P＜0.01)，因为这一信号通路在参与细胞信号调控起着关键作用，因此我们引入二者的激活剂Anisomycin和Dehydrocorydalinechlorid后，能够上调因敲减GBP1而下调的Caspase3的表达量以及细胞凋亡率（P＜0.01），表明GBP1能通过JNK/P38MAPK信号通路对BCG诱导的巨噬细胞凋亡进行调控。 结论:BCG感染能够引起巨噬细胞发生凋亡并导致鸟苷酸结合家族GBP1、GBP2、GBP5表达上调，敲低GBP1后能够降低凋亡相关基因的表达，并减少细胞凋亡率、降低细胞内ROS含量的积累，说明GBP1能够通过影响JNK/p38MAPK信号通路的激活从而抑制内源性凋亡的发生。
NETL