摘要
药品及个人护理品(Pharmaceuticalsandpersonalcareproducts,PPCPs)是一类新型污染物，种类超过3000种，因持续进入环境中造成“假持久”现象而越来越受到人们的关注。莱州湾是我国重要海水养殖区且附近城市人口稠密，畜牧和水产养殖业发达，导致大量含有PPCPs的生活污水、工业废水和养殖废水排入此海域。虽已有此海域抗生素含量的报道，但此海域PPCPs的检测方法及分布，典型PPCPs的种类及其对海洋生物的毒性损伤作用尚不清楚。为了筛选此海域典型PPCPs污染物并探讨其对水生生物的毒性损伤，本研究首先利用壬酸可以在亲水-疏水形态转化时产生大量气泡及低温下固化的特性，建立检测海洋环境样品中氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、土霉素(Oxytetracycline,OTC)和四环素(Tetracycline,TC)6种抗生素的泡腾辅助脂肪酸形态转化液液微萃取技术。其次利用丙酮的低温净化能力及辛酸在低温下固化的特点，建立检测海洋环境样品中三氯生(Triclosan,TCS)和甲基三氯生(Methyltriclosan,MTCS)的冷冻分散剂辅助脂肪酸漂浮液滴固化微萃取技术。然后应用所建方法对莱州湾海域水体中8种典型PPCPs的含量及分布进行研究并筛选得到ENR为此海域典型PPCPs物质。另外以当地大量养殖的褐牙鲆为海水养殖模式物种研究ENR在其体内代谢、分布、消除情况。最后对药物富集浓度高消除时间长的肝脏组织进行组织切片观察与肝酶测定并结合非靶向代谢组学技术对ENR的肝脏毒性进行研究并对指示ENR毒性损伤的生物标志物进行初步筛选。 本研究结果表明： (1)针对样品前处理中萃取剂与样品溶液无法彻底分离而导致的基质效应现象，成功建立泡腾辅助脂肪酸形态转化液液微萃取与检测技术对海洋环境样品中6种抗生素进行了测定。通过PB设计(Plackett-BurmanDesign,PBD)和中心实验设计(CentralCompositeDesign,CCD)筛选并优化得到最优的萃取条件为：脂肪酸体积258μL、硫酸体积406μL、萃取时间3.9min和Na2CO3体积354μL。本方法定量限范围为0.024-0.377(μgL-1)/(μgkg-1)，回收率范围为82.2-116.7%，优于多种传统前处理技术。本方法简便快捷，绿色环保，适用于海水、沉积物和海产品中氟喹诺酮类和四环素类抗生素的快速定性及定量分析。 (2)针对海洋环境样品中脂肪、蛋白等杂质难以有效去除的问题，成功建立冷冻分散剂辅助的脂肪酸漂浮液滴固化微萃取与检测技术对海洋环境样品中三氯生和甲基三氯生进行了测定。通过PBD设计和CCD设计筛选优化得到最优的萃取条件为：萃取剂体积146μL、分散剂体积793μL、离心时间3.0min和涡旋时间1.1min。本方法定量限范围0.022-0.060(μgL-1)/(μgkg-1)，回收率范围为83.3-103.5%，适用于海水、沉积物和海产品中TCS和MTCS的快速测定分析。 (3)利用前期研究建立的样品前处理及检测方法对莱州湾海域64个海水站位点2016年3月与8月分两个航次样品的分析测定发现，整个莱州湾地区，8种PPCPs都有检出，PPCPs检出率与浓度都是内湾明显高于外湾。NOR和CIP在莱州湾海域四个区域都有检出，在3月份与8月份两次样品中检出率都大于40%，是本次研究莱州湾海域分布最为广泛的PPCPs物质。其他6种PPCPs的检出率都小于25%。ENR的平均检测浓度为609.47ng/L，最高检测浓度为5314.04ng/L，为本研究莱州湾海域浓度最高的污染物质。检测得到各浓度范围：OFL：ND-619.05ng/L，NOR：ND-583.61ng/L，CIP：ND-751.39ng/L，OTC：ND-1726.80ng/L，TC：ND-376.32ng/L，ENR：ND-5314.04ng/L，TCS：ND-130.04ng/L，MTCS：ND-74.69ng/L。另外，通过PPCPs含量分布分析，最终筛选ENR为此海域典型PPCPs污染物。 (4)以ENR为海洋中典型PPCPs代表，以海水养殖物种褐牙鲆为模式生物，研究抗生素ENR及其主要代谢产物CIP在其体内的分布、消除规律。利用前文建立的脂肪酸形态转化液液微萃取技术对褐牙鲆血、肌肉、肝脏、肾脏、鳍、鳃、脑、皮肤、黏液中ENR和CIP的含量进行测定。结果在国家标准ENR使用规范给药的条件下，ENR和CIP在肝脏中的浓度和消除周期明显大于其他内脏器官，具有较高的药物损伤风险。 (5)通过对20、50、100mg/kg三个浓度ENR混饲喂养褐牙鲆5d和30d后血浆及肝组织中多种酶的含量、活性及肝脏组织病理学切片进行研究发现随着施药浓度的增加及时间的延长，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)整体升高，肝组织细胞间隙增大、细胞坏死、空泡现象，形成器质性肝损伤。碱性磷酸酯酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、γ-谷酰胺转移酶(γ-GT)升高，结合肝组织切片结果显示肝脏出现胆汁淤积型肝损伤。还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)随施药浓度和时间增加而含量降低，丙二醛(MDA)随施药浓度和时间增加而升高，显示ENR对褐牙鲆产生氧化损伤。 (6)结合超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)成功建立了适用于血浆和肝组织匀浆样品非靶向代谢组学分析方法并对不同ENR施药浓度和时间的血清及肝组织匀浆液样本进行非靶向代谢组学分析，结合多元统计分析及多种代谢组学数据库对血清及肝组织匀浆液中ENR损伤毒性生物标志物及影响代谢通路进行筛选。结果在低浓度、短时间(20mg/kg-5d)组血清与肝组织匀浆液中筛选得到2种ENR毒性损伤潜在生物标志物和2个与细胞膜脂质和蛋白合成相关代谢通路受到影响。 综上：本文针对传统样品前处理方法的不足进行改进，成功建立了两种新型的测定海洋环境中PPCPs含量的样品前处理技术，并对莱州湾海域64个站位海水样品中8种PPCPs含量进行测定。筛选得到ENR为此海域典型PPCPs污染物，以褐牙鲆为模式生物，以水产养殖给药标准施药ENR，发现肝脏中ENR残留浓度高，消除时间长。通过代谢相关酶的含量及活性测定，结合总胆汁酸，总胆红素含量测定和肝脏组织病理切片观察发现恩诺沙星对褐牙鲆肝脏产生器质性损伤、胆汁淤积型损伤和氧化损伤。最后对ENR的毒性损伤进行非靶向代谢组学技术研究，应用代谢组学技术对ENR的毒性损伤进行评价，在血清及肝组织匀浆液样本中筛选发现2种损伤潜在生物标志物和2个与细胞膜脂质和蛋白合成相关代谢通路受到影响。
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