摘要
纤毛是细胞表面伸出的细长突起，分为不动纤毛和动纤毛，执行多种生理学功能。纤毛形成缺陷或者功能紊乱会导致一系列的人类疾病，包括视网膜色素变性、多囊肾、不孕不育、内脏逆位等。 在斑马鱼上，纤毛发育缺陷经常会导致胚胎体轴弯曲，但其具体原因仍不清楚。zmynd10是人类原发性纤毛运动障碍的致病基因之一,本研究构建了zmynd10基因的斑马鱼突变体，zmynd10突变体具有体轴弯曲、耳石数目异常、心脏异位和肾脏囊肿等表型。同时，与kif3b、ift88等基因的斑马鱼突变体相比，zmynd10突变体体轴弯曲程度更严重。本研究通过对zmynd10，kif3b以及ift88突变体的研究，深入探索了斑马鱼纤毛突变体体轴弯曲的分子机制。 首先，本研究将荧光染料注射到斑马鱼胚胎后脑中，追踪记录荧光染料在kif3b、ift88、zmynd10三种斑马鱼突变体脑脊液中的运动轨迹，证明体轴弯曲程度跟脑脊液流动速度成负相关，体轴弯曲程度越大，脑脊液流动速度越慢。通过对不同体轴弯曲程度的斑马鱼神经管纤毛进行统计，发现斑马鱼脑脊液流动速度是由神经底板上动纤毛所占的比例决定的，动纤毛比例越高，脑脊液流速越快。 其次，为进一步研究体轴弯曲受何种基因调控，本研究对受精后30小时野生型斑马鱼胚胎和zmynd10突变体胚胎进行转录组分析，鉴定出两种表达下调的神经肽基因，urp1和urp2。过表达urp1基因的mRNA几乎可以完全营救斑马鱼纤毛突变体zmynd10、kif3b、ovl的体轴弯曲；而向zmynd10突变体神经管中注射Urp1多肽可以快速营救其体轴弯曲。同时，通过吗啉环（Morpholino）对这两个基因进行敲降，斑马鱼胚胎出现体轴弯曲表型，模拟了纤毛突变体体轴弯曲表型，说明这两个基因可以调控胚胎的体轴发育。但是urp1和urp2敲降后，纤毛的运动性没有受到影响，这暗示着在调节体轴发育的信号通路中，urp1和urp2位于动纤毛的下游。 第三，为了研究脑脊液中何种因子调控urp1和urp2表达，使用GPCR小分子库筛选得到几种化合物，可以不同程度营救zmynd10突变体体轴弯曲。其中地匹福林（DipivefrinHCl）营救效果最好，毒性最小。地匹福林是肾上腺素的前体物质，又用肾上腺素对zmynd10突变体进行处理，发现也有较好的营救效果。肾上腺素合成途径中的其他药物多巴、L-多巴等对zmynd10突变体也有一定程度的营救效果，而且合成肾上腺素的酶定位在儿茶酚胺类神经元中，靠近脑室，说明肾上腺素很有可能就是脑脊液中调控urp1和urp2表达的生物因子。 最后，进一步鉴定出urp1下游的受体基因，si:dkey-27n14.1，并将其命名为uts2ra。原位杂交及转基因实验的结果表明，uts2ra主要在斑马鱼胚胎背部的慢肌纤维中表达，而利用吗啉环对该基因进行敲降也可以导致胚胎体轴弯曲缺陷。另外，该缺陷不能由Urp1神经肽注射营救，表明该受体蛋白可能为Urp1的直接作用受体。然后，利用TALEN技术对该受体基因进行敲除，发现由于uts2r基因补偿效应早期胚胎并没有出现体轴弯曲表型，而当uts2ra突变体发育至19天左右，出现了脊柱侧弯表型，而且随着时间推移该表型越来越严重。对uts2ra突变体22天幼鱼进行免疫组化，发现肌肉形成没有受到明显影响；而对48天uts2ra突变体成鱼进行CT扫描，发现其脊柱骨骼发生明显变形，模拟人类特发性脊柱侧弯（IdiopathicScoliosis，IS）疾病表型。 综上所述，本研究深入地研究了斑马鱼纤毛突变体体轴弯曲的机制，发现了一个由纤毛运动引起脑脊液中多巴胺的信号传递，进而促进神经肽的分泌，最终激活其受体基因，引起肌纤维收缩从而引起体轴变直的一整套完整信号通路。该发现不仅全面阐述了斑马鱼纤毛突变体体轴弯曲的分子机制，更为人类特发性脊柱侧弯疾病的机理研究、早期预防及临床治疗提供了重要参考依据。
NETL