摘要
细胞微环境的稳态对细胞的生理活动产生着至关重要的作用，其中细胞粘度在细胞内物质的运输和信号传递过程中起着重要作用，如细胞内蛋白质的聚集和胞内信号分子的传递等。神经退行性疾病、糖尿病和恶性肿瘤等疾病的发生会引起细胞微环境内粘度发生异常，因此监测细胞内粘度对于疾病的诊断具有重要意义。肿瘤细胞由于增殖速度较快，血管供氧滞后，导致其长期处于乏氧状态，同时肿瘤细胞中常发生细胞自噬以维持癌细胞的正常发育，在乏氧和自噬过程中常伴随着粘度的变化，因此肿瘤的发生、发展、转移与肿瘤细胞粘度微环境密切相关。开发高特异性和高灵敏性的肿瘤细胞粘度的监测工具迫在眉睫。 近红外荧光成像具有非侵入性、灵敏度高、成本低、高特异性和组织吸收低等优点，成为监测细胞粘度的主要成像方式之一。目前的粘度荧光探针主要有半菁类乙烯型、BODIPY类、花菁类、AIE类等。除AIE探针外，其它粘度探针都存在聚集导致荧光淬灭（ACQ）、发射波长短和粘度敏感性低等问题；AIE类探针解决了ACQ的问题，但是存在因低水溶性和高蛋白结合能力导致对粘度的特异性低。因此，构建水溶性的具有高特异性和高灵敏性的粘度探针具有一定的挑战性。本文提出，引入聚乙二醇（PEG）基团改善染料的水溶性，在菁染料分子中位引入四苯乙烯（TPE）转子改善灵敏度，引入不同的杂环结构改善特异性，进而得到具有高灵敏度和高特异性的水溶性五甲川花菁粘度探针。进一步，本文利用高灵敏粘度探针研究在乏氧状态下，肿瘤演进关键因子转谷氨酰胺酶-2（TG2）在粘度变化中的调节作用。最后，本文利用高灵敏度粘度探针对皮下肿瘤模型实现了高灵敏度监测。本论文的研究内容如下： 1.本文首先通过聚乙二醇（PEG）修饰花菁分子，改善探针水溶性；同时利用不同杂环构建TPE-苯并吲哚花菁探针和TPE-苯并噻唑花菁探针，探讨不同杂环对粘度响应性的影响。紫外吸收和荧光发射光谱结果表明：苯并噻唑类探针相对于苯并吲哚类探针的粘度敏感性更高，荧光响应倍数更大。其中PEG修饰的TPE-苯并噻唑探针（ThPT）在甘油中的荧光强度比水中增加约97倍；探针对pH（3.0~11.0）、蛋白质、无机离子、氨基酸、盐类物质无明显荧光响应，证明ThPT探针在水中具有粘度高灵敏度；水中不同浓度探针荧光结果表明浓度对探针的荧光无明显影响，在琼脂糖凝胶空间网状结构内部探针荧光不受空间位置影响，证明ThPT探针荧光具有粘度的高特异性。 2.为研究肿瘤细胞乏氧和粘度的关系，使用ThPT探针测定乏氧状态下A549、BGC-823细胞系的粘度变化。实验结果表明，四种探针具有较低的细胞毒性和优异的细胞摄取能力；与常氧状态相比，ThPT探针孵育乏氧A549和BGC-823细胞荧光显著增强，说明乏氧条件下细胞内粘度微环境的明显增强；同时，常氧和乏氧细胞状态下，对照探针ThP（无粘度响应性）没有明显细胞荧光变化，说明ThPT探针可实现细胞水平高灵敏度和高特异性的粘度检测能力。 3.为了研究肿瘤演进关键因子TG2对细胞粘度微环境的调节作用，本论文应用粘度探针ThPT在A549细胞研究了TG2表达水平对粘度变化的作用。结果表明，在乏氧条件的A549细胞中加入TG2抑制剂丹酰尸胺（MDC）后，ThPT孵育的细胞荧光强度明显降低，说明TG2介导了肿瘤细胞内粘度的变化。 4.应用粘度探针研究对BGC-823荷瘤小鼠模型的肿瘤检测能力。经瘤内注射粘度响应探针ThPT和对照探针ThP，研究其对小鼠皮下瘤模型的成像能力。结果表明，ThPT在注射后半小时，荧光强度明显增强，12h时其肿瘤荧光信号是ThP组小鼠肿瘤信号的7倍左右，显示出良好的肿瘤成像能力，证明此探针ThPT可对肿瘤进行特异性高灵敏度检测，本研究对肿瘤粘度微环境的研究提供了一定研究基础。
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