摘要
本研究先优化测试产生血流增强效应的相关声学参数；再此基础上探索超声血流增强效应对肿瘤CD8+T细胞浸润的影响；并进一步探讨超声血流增强效应诱导的CD8+T细胞浸润对PD-L1抗体肿瘤治疗的增效作用及机制，从而为增强肿瘤免疫治疗提供一种超声治疗新方法。 目的： 1.优化并测试产生超声血流增强效应的相关声学参数，从而获得更有效、更稳定的血流增强效应，为基于该效应的相关研究或应用筛选出较理想的声学参数。 2.探索超声血流增强效应对肿瘤内CD8+T细胞浸润量的影响，为该效应增效肿瘤免疫治疗提供理论可行性。 3.探讨低强度超声激励微泡空化产生的血流增强效应联合PD-L1抗体肿瘤治疗的增效作用及其机制，为免疫检测点抑制剂的疗效改善提供一种超声治疗新方法。 方法： 1.荷瘤模型建立 将MC38结肠癌细胞悬浮液注射于小鼠右侧大腿根部皮下，形成圆形皮丘，建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。 2.优化及测试产生超声血流增强效应的声学参数 结肠癌荷瘤小鼠根据超声参数即机械指数（MI）、脉冲重复频率（PRF）的不同，两两组合随机分为七组：MI0.2-PRF200组、MI0.2-PRF500组、MI0.2-PRF1000组、MI0.4-PRF200组、MI0.4-PRF500组、MI0.4-PRF1000组、对照组，每组6只。除对照组外，其余六组小鼠均进行低强度超声激励微泡空化（USMC）治疗。治疗采用VINNO70诊疗一体机，该仪器配备Vflash空化调控组件并可对肿瘤靶区进行相控聚焦。治疗使用X4-12L线阵换能器，参数设置包括：频率4MHz、MI0.2或0.4、脉冲长度18个周期、PRF为200Hz或500Hz或1000Hz、脉冲/间隔时间1s/1s、治疗时间10min。微泡采用Sonazoid?脂质微泡经尾静脉缓慢推注。USMC前及USMC后的不同时间点采用超声造影分析（时间-强度曲线）肿瘤血流灌注情况。另，采用ONDA声场分布检测系统对USMC中所使用的的超声参数进行测试。 3.探索USMC产生的超声血流增强效应对肿瘤内CD8+T细胞浸润量的影响 结肠癌荷瘤小鼠随机分为四组：对照组、USMCMI0.4（采用低MI0.4行USMC治疗）、USMCMI1.2（采用高MI1.2行USMC治疗）、USMI1.2（仅采用高MI1.2行单超声辐照），每组13只。USMC治疗采用VINNO70诊疗一体机，治疗参数设置包括：MI0.4或1.2、PRF1000Hz、其余参数同方法2。各组治疗后，采用流式细胞术检测肿瘤中CD8+T细胞及抑制性免疫细胞Tregs（regulatoryTcells）的数量。采用超声造影分析肿瘤血流灌注的改变。光镜和电镜观察各组对应的组织学变化，并采用免疫荧光评估血管内皮标记物CD31的表达情况。 4.验证超声血流增强效应对CD8+T细胞浸润的促进作用 结肠癌荷瘤小鼠随机分为两组：USMC组、对照组，每组7只。USMC组在USMC治疗后即刻经尾静脉回输体外活化并标记CFSE的CD8+T细胞，对照组仅回输活化标记的CD8+T细胞。30min后，采用免疫荧光及流式细胞术比较分析USMC组及对照组肿瘤中CFSE+CD8+T细胞浸润量。 5.探讨USMC产生的超声血流增强效应联合PD-L1抗体肿瘤治疗的增效作用及其机制 结肠癌荷瘤小鼠随机分为四组：Control组（n=35）、USMC组（n=36）、anti-PD-L1组（n=36）、USMC+anti-PD-L1组（n=36）。通过绘制肿瘤生长曲线及记录小鼠生存期，评价抗肿瘤疗效。USMC联合anti-PD-L1的协同增效机制从以下四方面探索。⑴肿瘤局部anti-PD-L1释放的增加：采用ELISA法检测肿瘤中anti-PD-L1浓度。 ⑵肿瘤血管的正常化：采用超声造影分析肿瘤血流灌注、免疫荧光检测内皮细胞标志物CD31及细胞间粘附分子1（ICAM-1）的表达。⑶肿瘤免疫微环境的改善：采用流式细胞术分析肿瘤中CD8+T细胞数量及增值能力（Ki67表达）和杀伤功能（IFN-γ、GranzymeB的表达）、CD4+T细胞的分化情况（Th1、Th17、Tregs的比例）、髓源抑制性细胞（MDSC）所占比例以及肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化表型分布；采用ELISA检测趋化因子CXCL9（chemokine(C-X-Cmotif)ligand9）、CXCL10的分泌量。⑷肿瘤缺氧缓解：采用ELISA检测肿瘤内缺氧诱导因子1-α（hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α）的含量；免疫荧光分析肿瘤组织中血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）的表达。 结果： 1.超声参数MI及PRF对血流增强效应的影响 超声造影定量分析显示，MI0.4、PRF1000Hz的声学参数组合即MI0.4-PRF1000组，在USMC治疗后即刻、30min、2h、4h均表现为最优的血流增强效应。具体为：治疗后即刻，MI0.4-PRF1000组的峰值强度（peakintensity,PI）、曲线下面积（areaundercurve,AUC）均大于Control组、MI0.2-PRF200组、MI0.2-PRF500组、MI0.2-PRF1000组（P＜0.0001或P＜0.05）；治疗后30min、2h、4h，MI0.4-PRF1000组的PI及AUC均大于其余六组（P＜0.0001或P＜0.001）。经不同时间点观察发现，USMC产生的超声血流增强效应具有一定规律性：治疗后即刻出现，30min达峰值，2h开始降低，可持续至4h。 2.产生超声血流增强效应的相关声学参数测试 经ONDA声场分布检测系统测试，上述USMC治疗所使用的X4-12L换能器，其中心频率（4MHz）、脉冲长度（18个周期）、PRF（200Hz、500Hz、1000Hz）设定值与实测值一致。而MI设定值与实测值不一致，其中优选的声学参数MI0.4，所对应的峰值负压测值为0.46MPa，经公式（MI=峰值负压/2频率）计算获得的实际MI值为0.23。 3.比较高MI与低MI的USMC所产生的的肿瘤血流灌注效应及对应的组织学改变 低MI（设定值0.4，实测值0.23）USMC（USMCMI0.4组）治疗后，超声造影分析显示肿瘤血流灌注范围较治疗前增大，PI及AUC值均较治疗前升高（P＜0.01，P＜0.05）；对应的组织学表现为肿瘤微血管扩张。而高MI（设定值1.2，实测值0.68）USMC（USMCMI1.2组）治疗后，肿瘤灌注范围较治疗前缩小，PI及AUC值均较治疗前降低（P＜0.001，P＜0.05）；对应的组织学表现为肿瘤微血管破坏；同时，CD31的荧光分布范围及IOD值均小于对照组（P＜0.01）。结果表明，低MI的USMC产生的超声血流增强效应是基于肿瘤微血管的扩张，并非新生血管形成；而高MI的USMC产生的血流阻断效应是基于肿瘤微血管的破坏。 4.USMC对肿瘤中CD8+T细胞浸润量的影响 经流式细胞术分析显示，USMCMI0.4组肿瘤中CD8+T细胞比例及绝对值均高于对照组（均P＜0.001）；而USMCMI1.2组肿瘤中CD8+T细胞比例及绝对值均低于对照组（均P＜0.001）。各组间比较，肿瘤内Tregs数量无明显差异；但CD8+T细胞与Tregs数量比值比较，USMCMI0.4组明显高于USMCMI1.2组（P＜0.01）。结果表明，低MI的USMC产生的超声血流增强效应可促进肿瘤中CD8+T细胞的浸润，但不会增加抑制性免疫细胞Tregs的数量；而高MI的USMC引起血流阻断效应降低了CD8+T细胞数量，反向验证了超声血流增强效应对CD8+T细胞肿瘤浸润的促进作用。 5.超声血流增强效应可促进外源性活化CD8+T细胞肿瘤浸润 USMC组肿瘤内CFSE标记的外源性活化CD8+T细胞的分布范围大于对照组；CFSE+CD8+T细胞量为对照组的1.96倍（P＜0.01）。结果进一步验证了超声血流增强效应对CD8+T细胞浸润的促进作用。 结论： 1.低MI（设定值0.4，实测值0.23）、高PRF（1000Hz）的低强度超声激励微泡空化能产生有效、稳定、持续（4h）的肿瘤血流增强效应。 2.低MI超声激励微泡空化产生的肿瘤血流增强效应能有效促进CD8+T细胞肿瘤浸润，这将有助于增效肿瘤免疫治疗。而高MI超声激励微泡空化产生的肿瘤血流阻断效应可减少CD8+T细胞数量，反向验证了超声血流增强效应对CD8+T肿瘤浸润的促进作用。 3.USMC产生的血流增强效应协同增效了PD-L1抗体的抗肿瘤免疫疗效。联合治疗协同增效的机制包括以下四方面：⑴USMC增加了PD-L1抗体在肿瘤内的浓度；⑵联合治疗可能促进了肿瘤血管正常化；⑶联合治疗改善了肿瘤免疫微环境；⑷联合治疗可能缓解了肿瘤缺氧。 综上，USMC产生的肿瘤血流增强效应可作为一种增效PD-L1抗体肿瘤免疫治疗的超声新方法。
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