摘要
PDM1编码叶绿体伴侣蛋白CPN60α1，在植物的生长发育中扮演着重要角色。已有报道指出，当PDM1完全缺失时，植物将无法完成正常的生命周期，出现胚胎致死或幼苗黄化现象，严重阻碍了PDM1的功能研究。 本研究前期从拟南芥WT(Col-0)甲基磺酸乙酯(EMS)诱变库中发现并分离出一个黄叶突变体，通过基因定位、克隆和遗传回补等技术手段，确定了该黄叶突变体的突变基因为PDM1。pdm1弱等位基因的发现为进一步解析PDM1的功能提供了优良的实验材料。研究结果如下: 1.PDM1蛋白参与调控叶绿体发育和rRNA加工。正常生长条件下，拟南芥pdm1突变体株型较小，叶片发黄。通过对叶片叶绿素含量的测定，拟南芥pdm1突变体相对于野生型叶片叶绿素含量明显减少。通过显微观察发现，pdm1突变体叶绿体发育异常，叶肉细胞中的叶绿体数量明显减少。值得注意的是，pdm1突变体中的叶绿体显著积累了质体小球，淀粉颗粒相对减少。我们采用Northern印迹法，设计特异性探针对叶绿体23S、16S、5S和4.5SrRNA进行了检测。WT的23SrRNA特异性探针能检测到大小分别为0.5、1.1、1.3和1.8kb的4个主要条带。然而pdm1中还存在3个相应大小为3.1、2.9和2.4kb的额外前体rRNA，并且正常的23SrRNA水平显著降低，说明突变体在23SrRNA加工成熟过程中，发生了明显的前体累积。当用16S或5SrRNA特异性探针进行Northern印迹分析时，在WT和pdm1中均只检测到单一条带，其中16SrRNA水平没有明显差异，而5SrRNA的含量显著降低。此外，加工成熟的4.5SrRNA水平也明显下降。以上结果表明，PDM1突变特异性地干扰了叶绿体的正常发育和核糖体50S大亚基功能性rRNA的形成，但不影响叶绿体16SrRNA的加工成熟。 2.pdm1的显性负效应。在T-DNA突变体验证过程中，只能鉴定到突变ptcpn60α1的杂合子，纯合后代死亡。通过遗传杂交和PCR分析发现，杂合子pdm1/ptCPN60α1-2和pdm1/ptCPN60α1-3呈现WT和pdm1突变体的中间表型。对叶片叶绿素含量进行测定，其结果趋势与观察到的叶片颜色深浅一致。随后对突变体和各杂交株系进行Northern印迹分析，实验结果也与观察到的植株生长表型相关联，叶片颜色越黄，rRNA加工缺陷越严重。这些结果表明，pdm1可能在细胞水平上对ptCPN60家族的其他成员具有竞争性作用，其在总内源性ptCPN60蛋白中的相对增加对植物生长发育造成了负性影响。为了进一步验证这个观点，我们在WT背景下构建了包含由CaMV35S启动子驱动的编码pdm1基因组DNA的转基因系，也同样进行了Northem印迹分析。实验结果支持了pdm1以剂量依赖的方式竞争性地接管叶绿体定位的CPN60功能的观点，从而对植物的生长发育造成显性负效应。 3.ptCPN60蛋白家族功能冗余。对ptCPN60蛋白家族同源性分析后发现，PDM1与ptCPN60蛋白家族内的其他蛋白具有很高的同源性，提示我们PDM1蛋白的家族成员之间具有潜在的功能冗余。为了说明这一点，我们利用转基因技术在pdm1中过量表达了ptCPN60α2、β1、β2和β3，并通过Northem印迹法进行了分析验证。这些转基因株系均能部分恢复pdm1突变体表型，但ptCPN60β1和β2的恢复效果优于ptCPN60α2和β3。结果表明ptCPN60蛋白家族在叶绿体发育和rRNA加工方面存在功能冗余。
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