摘要
日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)是黄病毒科黄病毒属的成员，它也是引起人和动物乙型脑炎（乙脑）的病原。乙脑在亚洲大部分地区和西太平洋地区普遍流行，大约有三十亿人生活在JEV威胁区。众所周知，JEV也能够感染健康猪群，并使其成为自然界主要的放大宿主。控制JEV在猪群之间的感染不仅可以减少其对养猪业造成的经济损失，而且具有重要的公共卫生意义。乙脑无特效疗法，疫苗免疫接种是预防该病的主要途径。目前主要有减毒活疫苗(SA14-14-2)和灭活疫苗（小鼠脑源性和Vero细胞源性），两种疫苗被广泛用于人类和猪群接种，预防JEV的感染，但乙脑在南亚、东南亚和东亚部地区普遍流行，每隔几年就会爆发乙脑疫情。因此，开发针对JEV的新疗法是必要的。 Mx蛋白是由Ⅰ/Ⅲ型干扰素(IFN)诱导产生的存在于几乎所有脊椎动物中具有广泛抗病毒活性的蛋白质，它能抑制如水泡性口炎病毒(VSV)，流感病毒，猪瘟病毒(CSFV)，口蹄疫病毒(FMDV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的增殖。最近发现人MxB蛋白是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的抑制因子。猪Mx1(poMx1)和Mx2(poMx2)蛋白与人Mx蛋白（huMxA和huMxB）的核苷酸序列和氨基酸序列相似度很高，并且这两种蛋白均位于靶细胞的细胞质中，表明它们针对RNA病毒可能具有类似的抗病毒特性。 1.重组人干扰素α抑制JEV增殖的研究 本试验为了研究重组人干扰素α(huIFNα)在仓鼠肾细胞（BHK-21）上对日本乙型脑炎病毒(JEV)增殖的影响。本研究将商品化的重组人干扰素作用感染JEV的BHK-21细胞后，通过Westernblot、噬斑减少试验鉴定huIFNα对JEV作用的量效关系和时效关系，再通过间接免疫荧光试验鉴定抗病毒效果。结果表明10ng/mLhuIFNα处理细胞后，JEV的增殖能力下降了92倍，Westernblot显示细胞中JEV的非结构蛋白NS5含量显著下降，说明低浓度的huIFNα能明显抑制JEV的增殖。200ng/mL的huIFNα处理细胞后，在接毒24h和48h后，与对照组相比JEV含量分别下降了821倍和15倍，这表明huIFNα在BHK-21上抑制JEV的增殖具有时间依赖性。间接免疫荧光试验也支持了上述结果。我们的研究为重组干扰素在JEV的治疗和预防作用提供理论基础。 2.Mx蛋白不是干扰素α抑制JEV增殖的必需条件 在本研究中，我们使用JEV强毒株和弱毒株刺激BHK-21并且用huIFNα做对照，表明JEV强毒株和弱毒株均不能诱导BHK-21产生干扰素刺激基因的下游蛋白，如Mx1蛋白、Mx2蛋白和Viperin蛋白。为了独立研究Mx1蛋白和Mx2蛋白在干扰素α刺激的BHK-21中是否具有抑制JEV增殖的功能，我们使用siRNA分别下调Mx1和Mx2蛋白的表达，使用Westernblot和噬斑减少试验分别检测细胞中病毒蛋白含量和子代病毒数量，尽管这两种蛋白分别下调了66％和79％，但均不影响huIFNα对JEV的抑制作用，我们过表达了Mx1蛋白和Mx2蛋白，也得到了上述类似的结果，总之，Mx蛋白不是干扰素α抑制JEV增殖的必需条件。 3.BFA抑制JEV增殖的研究 我们过表达Mx1和Mx2蛋白，使用BFA破坏病毒诱导的膜系统，发现BFA单独存在即可抑制JEV的增殖。为了深入探究BFA对JEV的增殖影响，我们使用Westernblot、噬斑分析和间接免疫荧光试验进行研究。结果表明病毒的E，NS1和NS5蛋白在BFA处理细胞后均显著下降，并且用2.5μg/mL处理后病毒的含量下降了209倍。我们随后使用5μg/mL的BFA研究其抑制JEV增殖的时效关系，结果显示病毒含量与BFA处理细胞时间呈负相关关系，表明BFA抑制JEV增殖具有时间依赖性。间接免疫荧光试验进一步证实BFA对JEV的增殖产生明显抑制作用。总之，我们的首次证实了BFA可以在BHK-21细胞中抑制JEV的增殖。
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