摘要
由于科学技术的进步，生产方式发生巨大变化，养殖者的养殖倾向完全转变，经济效益较高的品种更受欢迎，个别本土家畜甚至走向灭绝，比如阳坝牛、高台牛等。外来品种也不断冲击本土优良品种的数量，本土优良畜种岌岌可危，同时有些地方品种近亲繁育严重，会出现繁育困难、成活率低及优良基因难以延续等问题，精液冷冻技术的出现也大幅改良现有的繁育技术。为了更好地保护本土优良草食家畜品种，本试验基于人精液DNA试剂盒提取法，优化家畜冷冻精液DNA纯化方法，使用对畜种伤害最小的采样方式，如精液和毛发，并探讨冷冻精液中影响DNA提取质量的因素，以获得良好的DNA质量便于后续的测序分析。同时本研究以大通牦牛、德保矮马为主要研究对象，进行COI、CYTB、牛D-loop片段的遗传分析，主要有以下三部分: 试验一、家畜冷冻精液DNA纯化的优化及影响因素分析 为了得到良好的冷冻精液DNA纯化效果，本试验使用摩拉水牛冷冻精液，按100μL(或200μL)样品初始量，以及0.5、1、1.5、2、3和5h的蛋白酶解时间，使用人精液DNA试剂盒法纯化DNA。DNA产物从浓度、A260/A280和A260/A230三方面，结合琼脂糖凝胶电泳和PCR检测进行分析，最终确定DNA纯化的最佳精液初始量以及最佳蛋白质酶解时间。在此基础上，纯化67份来源于牛、马、驴等不同家畜品种的冷冻精液DNA，同时测定每份精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖的含量，结合精液样品的冻存时间，研究以上4种因素对DNA纯化质量的影响。结果显示:使用100μL冷冻精液，蛋白酶解3h的纯化效果最好，而且酶解2和3h的DNA产物，均可以满足后续核基因组和线粒体基因组常规PCR的要求。家畜冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖含量与提取DNA浓度、A260/A280和A260/A230纯度在不同程度上呈斯皮尔曼负相关，其中果糖是干扰DNA纯化的关键因素，同时样品的冻存时间与DNA质量存在显著正相关。虽然冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖的成分可以减轻冷冻复苏对精子的损伤，但这些成分的增加，会对DNA纯化质量产生一定的负面影响，即使它们随着冻存时间及DNA纯化时酶解时间的延长而有所消耗。 试验二、大通牦牛、德保矮马线粒体基因的进化分析初步研究 为对大通牦牛、德保矮马进行遗传进化分析，在上述试验的基础上，提取10头大通牦牛精液样本、8头德保矮马毛发样本的DNA，扩增其COI、CYTB和牛D-loop片段并进行测序，分析其遗传关系、G/C含量及系统发育树。结果表明:以上3种基因均扩增成功得到峰图良好的序列，长度均在引物设计的长度，这些基因的单倍型含量较高，多态性信息位点丰富，可以作为进化分析得到基因序列。这些线粒体基因的碱基A+T含量远大于G+C含量，A+T含量最低为德保矮马的CYTB基因53.9％，符合线粒体DNA的组成特点。基于牛CO、CYTB基因序列的NJ法系统进化树，能够较清晰明确区分试验物种，证明了其作为DNA条形码在大型草食家畜属水平鉴定的可行性。但马COI、CYTB基因及牛D-loop片段的进化树不能清晰聚类各物种，在马种级别的鉴定上还存在一定的交叉问题，该方法还需结合形态学数据或将更多的线粒体基因序列信息联用。 总之，本试验优化后的人精液DNA试剂盒法可完全适用于家畜冷冻精液DNA的纯化，明确了影响精液DNA纯化的影响因素，进一步证明了线粒体基因COI、CYTB基因在分析牛亚科草食家畜中的可行性。
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