摘要
我国是海洋食品生产和消费大国，但其产品中重金属残留超标现象仍较多，是消费者普遍关注的热点，也是食品行业多年普遍面临的难题。应用活性微生物脱除重金属是目前食品行业脱重金属的研究热点之一，良好的重金属抗性和重金属脱除能力是应用该方法的前提。本文以多抗性库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii A16）为研究对象，系统研究了该酵母对水溶液和培养基中镉的抗性以及脱除能力，并研究了不同胁迫培养条件对该酵母镉抗性和镉脱除能力的影响。通过研究过表达MET14和GST基因对P.kudriavzevii A16镉吸附特性的影响，重点揭示了硫同化通路和谷胱甘肽（GSH）代谢通路对提高P.kudriavzevii A16镉抗性的作用。 1.系统研究了P.kudriavzevii A16对水溶液中镉离子的吸附能力和吸附机理。结果表明，P.kudriavzevii A16对10ppm含镉水溶液中镉脱除率超过80%。吸附动力学结果表明P.kudriavzevii A16对水溶液中镉离子的吸附符合拟二级动力学方程，颗粒内扩散模型进一步表明P.kudriavzevii A16对镉离子的吸附速率是由液膜扩散和颗粒内扩散共同控制的。吸附等温线分析表明P.kudriavzevii A16对水溶液中镉离子的吸附较好拟合Langmuir-Freundlich模型，吸附过程包括物理吸附和化学吸附。吸附热力学分析表明该反应可自发进行，升高温度有利于镉离子的吸附。通过研究P.kudriavzevii A16菌体各组分对镉离子的吸附情况，发现镉离子大部分被吸附在细胞壁及胞外多糖。通过遮蔽P.kudriavzevii A16细胞壁上的官能团发现羧基是吸附镉离子的主要官能团，羟基对镉离子的吸附也有重要作用。结果表明，P.kudriavzevii A16对水溶液中镉离子的吸附是快速而高效的。 2.通过对氯化钠预培养后P.kudriavzevii A16镉抗性与镉脱除率的研究，表明氯化钠预培养可以提高P.kudriavzevii A16的镉抗性和镉脱除率。为了揭示P.kudriavzevii A16应对镉胁迫以及盐胁迫后镉抗性提高的机理，运用RNA-Seq技术研究转录水平下镉胁迫与正常培养、盐-镉胁迫与镉胁迫的差异表达基因及代谢通路。盐-镉胁迫与镉胁迫相比，共筛选出差异表达基因239个，其中上调表达145个基因，下调表达94个基因。上调表达的基因功能包括GSH代谢、能量代谢、应激反应等功能。镉胁迫与正常培养相比，共筛选出1142个差异表达基因，其中上调表达438个基因，下调表达704个基因。上调表达的基因富集到的通路包括硫代谢、甾醇代谢、蛋白酶体以及糖酵解和糖质新生通路等。 3.采用硫酸盐预培养及添加含硫氨基酸的方法研究硫元素对P.kudriavzevii A16镉抗性和镉脱除率的影响。结果表明，外源含硫化合物可提高P.kudriavzevii A16的镉抗性和镉脱除率，降低胞内镉积累量，并维持镉胁迫下P.kudriavzevii A16的正常形态。通过对胞内镉解毒物质含量的研究发现：硫酸盐（硫酸钠和亚硫酸钠）预培养以及添加半胱氨酸（Cys）可提高镉胁迫下P.kudriavzevii A16胞内GSH含量及谷胱甘肽S-转移酶（GST）酶活；亚硫酸钠预培养和添加Cys还可以提高镉胁迫下P.kudriavzevii A16的Cys含量；硫酸钠预培养和添加Cys可提高P.kudriavzevii A16胞内金属硫蛋白（MT）含量。从生化角度证明外源含硫化合物可通过提高P.kudriavzevii A16胞内与镉鳌合的物质含量来提高酵母的镉抗性。 4.为了进一步分析硫同化基因在提高P.kudriavzevii A16镉抗性中的作用，将MET14基因在该酵母中过表达，获得镉抗性与镉脱除率都明显提高的重组菌株M48，在20ppm镉胁迫下，M48的镉抗性提高了76.00%，镉脱除率提高了46.64%。过表达MET14基因可导致M48胞内镉积累量明显下降，YCF1、Yor1等镉转运蛋白基因的表达量提高，促进了镉的外排。此外，重组菌株M48胞内的亚硫酸盐、Cys以及GSH的含量明显高于野生菌株，ROS含量和细胞死亡率也明显降低，说明过表达MET14基因可通过提高GSH的含量来缓解镉损伤。 5.构建具有不同筛选标记的通用基因过表达载体，并将GST基因在P.kudriavzevii A16中过表达，获得镉抗性与镉脱除率都明显提高的重组菌株G43。在20ppm镉胁迫下，G43菌株的镉抗性提高了37.81%，镉脱除率提高了105.92%。对G43菌株进行氯化钠预培养之后，镉胁迫下GST基因的相对表达量和GST酶活进一步提高，与未经过盐胁迫的G43菌株相比，其镉抗性与镉脱除率分别提高了27.86%和13.45%。镉胁迫下G43菌株胞内镉积累量增多，经过氯化钠预培养之后，胞内镉积累量下降。镉胁迫下G43胞内GSH的含量明显升高，ROS含量和细胞死亡率低于野生菌株，说明过表达GST基因可通过提高镉与GSH共轭结合的速率来缓解镉毒性。 重金属污染是目前食品行业中最为严重且难以解决的问题之一。本研究成果丰富了微生物抵御镉胁迫的基础理论，为应用活性微生物脱除食品原料中的重金属提供重要参考，并为构建和改良高效脱镉菌种提供有益参考，也为后续改造P.kudriavzevii的代谢通路以及工业化应用提供重要的生物学信息。
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