摘要
大菱鲆是我国常见的经济鱼类，也是常见的引起过敏的食品之一，其中，小清蛋白是大菱鲆的主要过敏原。为解决一部分过敏患者的需求，开发低致敏性鱼肉食品迫在眉睫。在众多的过敏原免疫活性消减方法中，酶交联法可以在温和的环境下有效实现免疫活性的消减，操作简便且可控。研究表明，酪氨酸酶可以催化小清蛋白中的酪氨酸残基生成多巴，随后进一步反应生成邻苯二醌类产物，从而发生交联。在咖啡酸存在的情况下，咖啡酸可以作为酶作用底物参与反应并使反应加快。因此，本课题选用酪氨酸酶和咖啡酸在37℃下对小清蛋白进行交联处理，探究交联对小清蛋白结构及过敏原性的影响。通过研究，得到如下成果： 1.大菱鲆小清蛋白的纯化与鉴定 将鲜活的大菱鲆杀死后，取脊背肉，使用匀浆机搅拌。随后按照鱼肉：抽提液=1:5（质量体积比）的比例向大菱鲆鱼肉中加入抽提液，4℃下抽提过夜。二次盐析后离心取沉淀并将沉淀复溶，对所得溶液进行电泳以及免疫印迹鉴定，鉴定其为小清蛋白。 2.酪氨酸酶和咖啡酸交联对小清蛋白结构以及IgG结合能力的影响 在37℃下使酪氨酸酶和咖啡酸与小清蛋白进行反应，时间为12h，结束后沸水浴10min使酶失活并终止实验。电泳结果显示，泳道上可观察到24kDa，36kDa等处附近产生新条带，这说明小清蛋白发生交联，蛋白分子发生了聚集。圆二色谱（CD）结果显示，交联后α螺旋含量降低了10.3%，β折叠和无规则卷曲含量分别增多了30.8%和10.1%。紫外光谱结果显示，交联后最大吸收峰所在波长发生显著红移，从258nm变为282.5nm。内源荧光结果显示，交联后荧光强度降低，最大下降幅度为68.67%，最大吸收峰所在波长发生明显红移，从337nm变为352nm。此外，交联后的小清蛋白表面疏水性游离氨基酸含量分别下降59.95%和50%。在免疫活性方面，通过免疫印迹可以看出，酪氨酸酶和咖啡酸交联后的小清蛋白弥散现象严重，原条带几乎全部消失，但新生成的条带一定程度上也能被IgG识别。酶联免疫吸附测定结果表明，交联后小清蛋白免疫活性最大下降幅度可以达到34.94%。 3.酪氨酸酶和咖啡酸交联对小清蛋白潜在致敏性的研究 通过交联，小清蛋白激发RBL-2H3细胞释放β-氨基己糖苷酶，组胺，类胰蛋白酶，半胱氨酰白三烯和前列腺素D2以及细胞因子的能力显著下降。β-氨基己糖苷酶释放率最高可以下降为原有水平的66.02%，其他活性介质以及细胞因子的释放率也有不同程度的下降。这说明交联可以通过抑制脱颗粒反应来抑制小清蛋白激发效应细胞释放活性介质和细胞因子的能力，从而在细胞水平上降低小清蛋白的致敏能力。 4.酪氨酸酶和咖啡酸交联对小清蛋白消化稳定性影响的研究 小清蛋白在模拟胃液消化稳定性差，2min时小清蛋白几乎被全部消化；但模拟肠液消化稳定性较高，经过240min的消化，小清蛋白条带依然清晰。通过交联，小清蛋白的模拟胃液消化稳定增强，60min后小清蛋白依然具有可视电泳条带；模拟肠液的消化稳定性减弱，小清蛋白条带明显减弱，消化产物明显增多。在IgG结合能力方面，交联后小清蛋白IgG结合能力降低，在模拟胃液消化中15min结合能力显著减弱，在模拟肠液消化中1min后，免疫印迹条带即不再明显。这些都能够说明，交联对小清蛋白的消化稳定性影响显著。 综上所述，酪氨酸酶和咖啡酸能在温和条件下通过对大菱鲆小清蛋白进行交联来改变其结构和功能性质，使其IgG结合能力和潜在的致敏性均显著降低并显著影响其消化稳定性。因此，本研究有助于阐明食品加工过程中过敏原的变化规律，并为低致敏性食品的研发工作提供理论指导。
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