摘要
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种严重的猪传染性疾病，感染动物出现白细胞减少、发热、出血和流产等症状，具有较高的病死率。CSF严重影响养猪业的健康发展，因此我国和一些国家采用我国上世纪50年代研制的兔化弱毒疫苗（C株疫苗）预防接种来控制疫情，取得了良好的效果。CSFV石门株和C株感染宿主后引起不同的免疫反应，石门株能抑制宿主的天然免疫进而建立持续性感染，而C株能刺激宿主产生特异性抗体起保护作用，但其机理尚不清楚。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为天然免疫系统中模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）家族成员之一，识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)之后诱导Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的产生。本团队前期研究发现CSFV石门株和C株能够引起TLRs基因差异性表达，并且石门株抑制TLR3介导的信号通路来影响宿主天然免疫；通过慢病毒包装系统过表达CSFV石门株蛋白来研究其对TLRs信号通路的影响，发现病毒蛋白不同程度的引起TLRs信号通路的变化。鉴于CSFV石门株与C株引起宿主不同的免疫反应，因此，本文旨在研究CSFV C株及其非结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）TLRs介导的天然免疫的影响，获得了以下结果。 （1）CSFV C株感染3D4/21细胞后的不同时间，C株对TLRs介导的天然免疫应答的影响呈现动态调节过程。C株感染24h后，显著抑制TLR2、TLR7及其下游关键分子MyD88、IRF7的表达（P＜0.05或P＜0.01）而显著促进TLR3、TLR4和TRIF表达（P＜0.05），主要抑制TLR2和TLR7介导的信号通路，从而避免TLRs过度激活；C株感染48h和72h后，显著上调TLR2、TLR3、TLR4和TLR7及其信号通路下游关键蛋白（MyD88、TRIF、IRF3和IRF7）、下游免疫效应因子Ⅰ型干扰素和IL-6表达（P＜0.05或P＜0.01），从而有助于清除病毒。 （2）通过慢病毒包装系统在3D4/21细胞中过表达CSFV C株非结构蛋白，研究CSFV C株非结构蛋白通过TLRs信号通路对宿主天然免疫的影响。结果表明，p7、NS4B、NS5A和NS5B均能诱导ERK1/2的磷酸化；p7促进TLR2、TLR3、TLR7和TRIF的表达，并抑制TLR4表达，主要通过TLR3介导的信号通路影响天然免疫；Npro上调TLR2和TLR7的表达；NS3促进TLR2和TLR7表达而抑制TLR3表达；NS4A促进TLR2和TLR3表达；NS2上调TLR2、TLR7、MyD88、IRF7和IFN-α表达，主要促进TLR7介导的信号通路；NS4B上调TLR3、TRIF、IRF3和IFN-β表达，促进TLR3-TRIF-IRF3依赖的信号通路来影响天然免疫；NS5A上调MyD88、IRF7、IFN-α的表达，促进MyD88-IRF7介导的TLRs信号通路；NS5B促进TLR2和TLR4表达，并且促进TLRs信号通路下游关键蛋白以及Ⅰ型干扰素、促炎细胞因子IL-1β和IL-6的表达。 综上所述，本研究表明在CSFV C株感染3D4/21细胞的早期（24h），C株通过抑制TLR2和TLR7介导的信号通路来阻止TLRs过度激活，从而防止C株疫苗毒过早被清除；C株感染的中晚期（48h，72h），通过促进TLR2、TLR3、TLR4和TLR7介导的信号通路诱导Ⅰ型干扰素和IL-6表达，从而有助于清除病毒；表明CSFV C株各非结构蛋白通过不同程度地促进或抑制TLR2、TLR3、TLR4和TLR7介导的信号通路来调节下游细胞因子的表达，从而影响宿主的天然免疫。研究结果为阐明CSFV C株及其非结构蛋白通过TLRs介导的信号通路对天然免疫的影响提供了新的科学资料。
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