鸽圆环病毒分子流行病学调查及检测方法的建立

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中文摘要：鸽圆环病毒（Pigeon circovirus,PiCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属。病毒含有两个主要的开放阅读框，分别编码核衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）和复制相关蛋白（Replication associated protein,Rep）。单纯的PiCV感染几乎没有临床症状，但能引起严重的免疫抑制，导致机体对病毒、细菌、真菌和寄生虫等各种病原体的免疫应答不足，进而引起严重的继发性感染，并表现出相应的临床症状。由继发感染导致的死亡率可高达100%，这为我国鸽子的健康养殖带来了巨大的威胁。近年来，国内赛鸽运动正处于蓬勃发展阶段，但对于其疾病的相关研究还不丰富，尤其是在PiCV的流行和遗传进化情况方面还处于空白阶段。本文拟从PiCV的分子流行病学调查、全基因组克隆测序及遗传变异等方面进行研究，同时建立可视化的环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）检测方法。具体研究内容如下： 1.中国部分省份赛鸽中PiCV的感染情况本研究旨在调查中国部分地区赛鸽群体的PiCV感染与流行情况。2016到2019年间，从北京，陕西和河北等11个省的39个赛鸽公棚分别随机采集无临床症状的赛鸽血清样品（571份）和表现一定临床症状（包括：飞行能力差、精神沉郁、呼吸困难、呕吐、腹泻、羽毛蓬乱或表现出神经症状，甚至突然死亡）的赛鸽组织样品（51份）共622份。并采用本试验建立的PCR方法进行检测。结果显示被调查的无任何临床症状的赛鸽和患病赛鸽均存在PiCV的感染，阳性率分别为18.6%和27.4%；总阳性率为19.3%。其中，病毒携带或隐性感染可能会成为赛鸽健康养殖的一大隐患，应引起足够的重视。 2.鸽圆环病毒全基因组的序列分析本试验共获得了67条PiCV全基因组序列。通过与NCBI公布的参考序列比较分析可知，国内赛鸽中流行的PiCV基因组具有高度多样性，主要体现在：①国内赛鸽中流行的PiCV毒株之间的同源性低于国内外的其他流行株。②在Cap蛋白C末端和N末端各发现了一个正选择位点，以及共计28个新的氨基酸突变。③本试验通过序列比对发现，ATT与GTG也可能作为Cap蛋白的起始密码子，并推测不同的起始密码子起始Cap蛋白翻译的效率不同。本部分研究有助于了解PiCV的变异情况，为将来研发有效的基于Cap蛋白的亚单位疫苗以及对该病毒的深入研究提供参考资料。 3.国内赛鸽群体PiCV流行株的重组及遗传进化分析以GenBank数据库及本试验鉴定的PiCV全基因组序列为研究对象，应用RDP4、Simplot和MEGA5.0软件对重组事件进行分析和验证。结果发现我国赛鸽中流行的PiCV毒株共存在10个重组事件，共包含23个重组毒株，占流行株的34.3%；大小亲本可能来自于国内的肉鸽、波兰和日本的赛鸽或美国的野鸽。遗传进化分析显示，所有PiCV毒株形成了8个分支，我国赛鸽中流行的PiCV在其中的7个分支均有分布，并且与世界各地的流行株均存在同源性较高的序列；此外，还出现了同一个公棚的流行株分布在不同的遗传进化分支的情况。本部分研究反映了国内流行株在遗传进化关系上的复杂性，预示了防控的难度；也反映了基因重组是PiCV进化的主要动力之一；更重要的是，提示我国的赛鸽的养殖应做好竞翔，引种和集鸽时的生物安全工作，防止病毒的广泛传播。 4.可视化LAMP检测方法的建立将本试验获得的毒株序列和所有参考序列进行比对。选择保守区进行LAMP引物的设计。同时为了减少检测过程中气溶胶的污染，本试验在LAMP反应体系中按比例加入了钙黄绿素和氯化锰，建立了可视化的LAMP检测方法，68℃，50min即可完成检测。反应后可根据反应液的颜色判定结果：阳性为亮绿色，阴性为橙黄色。该方法检测限度可以达到10copies/μL。其灵敏度高，重复性好，与鸽群常见其他疾病均无交叉反应。本部分研究为开发有实用价值的PiCV的检测试剂盒提供了参考。本研究明确了PiCV在我国部分地区赛鸽中的流行情况、流行株的序列信息、重组情况和遗传进化关系，为该疾病的防控及亚单位疫苗的研制提供参考数据，同时也有助于今后对该病毒的深入研究。此外，本试验建立的可视化LAMP检测方法可为该病的防控和早期诊断提供技术支持。

作者：

王浩然

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关键词：

鸽圆环病毒分子流行病学调查遗传进化环介导等温扩增

授予学位：

硕士

学科专业：

预防兽医学

导师：

王承宝

学位年度：

2021

学位授予单位：

西北农林科技大学

语种：

中文

中图分类号：