摘要
真核延伸因子2激酶（eEF2K）是一种Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶，能够催化其下游底物eEF2的Thr56位点磷酸化，抑制翻译延伸。eEF2K作为一种α-kinase，其结构与广泛存在的蛋白激酶不同，在多种肿瘤细胞中高表达或高度活化，参与肿瘤细胞存活、增殖、侵袭和转移等，是抗肿瘤药物研究的潜在靶分子。但是深入研究发现，eEF2K在不同肿瘤中发挥的作用不同，甚至相反。其中在细胞增殖方面，eEF2K抑制能够促进结肠癌和宫颈癌细胞增殖，但对乳腺癌和胶质瘤细胞增殖则起抑制作用。为了更好地揭示eEF2K在不同肿瘤中的作用，本论文采用非小细胞肺癌细胞株A549作为研究对象，研究eEF2K对A549细胞体内外生长中的影响，探讨其分子作用机制。该研究将为今后阐明eEF2K在肿瘤中的作用与选择性，明确其作为潜在的抗肿瘤药物靶点奠定基础。 1.增殖曲线检测和平板克隆实验发现，eEF2K表达抑制能够促进A549细胞增殖和克隆形成，而过表达eEF2K则对细胞增殖起抑制作用。并且eEF2K影响的A549细胞增殖与蛋白质合成无关。 2.WesternBlot检测eEF2K表达变化对A549细胞增殖信号分子的影响发现，eEF2K抑制能够促进A549细胞中STAT3蛋白Tyr705位点的活化，而对其他增殖蛋白的活化影响较小。同样地，eEF2K过表达对STAT3(Tyr705)活化起抑制作用。并且eEF2K表达变化并不影响A549细胞中增殖相关蛋白本底的表达。 3.Co-IP实验后蛋白质谱检测发现，在A549细胞中，PKM蛋白可以与eEF2K蛋白发生结合。 4.在A549细胞中，eEF2K、STAT3和PKM2三者之间可以互相结合。并且eEF2K表达变化能够影响与PKM2结合的STAT3的活化，但不影响与PKM2结合的STAT3的蛋白量。 5.RNA干扰实验发现，特异性敲除PKM2蛋白的表达能够拮抗A549细胞中由eEF2K抑制诱导的STAT3活化增加。 6.乳酸分泌实验、葡萄糖摄取实验和ATP实验分析发现，抑制eEF2K的表达能够增加A549细胞的葡萄糖摄取和乳酸分泌，抑制ATP产生。同样地，eEF2K过表达则对A549细胞代谢起抑制作用。这一现象可能与在A549细胞中，eEF2K表达诱导了c-Myc蛋白的表达变化有关。并且抑制A549细胞中STAT3的表达和活化能够拮抗eEF2K诱导的c-Myc表达改变。 7.抑制A549细胞中PKM2蛋白的表达，能够阻断eEF2K抑制诱导的STAT3(Tyr705)蛋白活化增加和c-Myc蛋白表达上调。 8.eEF2K表达和活性的抑制均能够促进A549细胞中PKM2二聚体活性增加，诱导其蛋白激酶活性增强。同样地，过表达eEF2K能够促进A549细胞中PKM2四聚体的形成，诱导其丙酮酸激酶活性升高。 9.eEF2K抑制促进裸鼠体内A549细胞移植瘤形成和生长，诱导细胞中STAT3活性升高和c-Myc表达增强。 本课题研究发现，eEF2K的表达水平和活性能够影响A549细胞在体内外的增殖过程，其机制可能由于eEF2K表达水平变化能够诱导A549细胞中PKM2蛋白激酶活性改变，诱导细胞中PKM2对STAT3(Tyr705)的活化，进而影响c-Myc的表达，从而对A549细胞的增殖起调控作用。 本课题明确了eEF2K在A549细胞体内外增殖中的作用，并初步阐明其作用机制，补充了eEF2K在A549细胞增殖中研究的空白，也揭示了除了真核延伸因子激酶作用外，细胞中eEF2K很可能还发挥着其他作用，值得进一步探究。
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