摘要
手性β-氨基酸及其衍生物是合成多种天然产物、生物活性分子的关键结构单元，开发高效、绿色的合成方法具有重要的研究意义。酶作为生物催化剂可以催化广泛的化学反应，且一般具有反应条件温和、环境友好、选择性高等优势。氨基酸脱氢酶（AADHs）催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸的还原胺化反应，由于其原子经济性，在手性氨基酸的不对称合成中具有巨大的应用潜力。然而，与广泛被研究的α-AADHs相比，利用β-AADHs合成手性β-氨基酸的报道还很少。目前，β-AADH家族中唯一已知的成员只有L-赤式-3，5-二氨基己酸脱氢酶(3，5-DAHDH)，且这类酶一般只对天然底物(3S,5S)-二氨基己酸((3S,5S)-DAH)具有较好的活性，严重限制了其应用范围。另外，目前还没有这类酶晶体结构的报道，其底物识别和催化机理尚不明晰，这对于蛋白分子改造来说是一个巨大的挑战。 本文通过基因挖掘，对不同微生物来源的23个3，5-DAHDHs在Escherichiacoli中进行了异源表达。通过测定对天然底物及另外9种不同β-氨基酸底物的活性发现，绝大部分3，5-DAHDHs对(3S,5S)-DAH有较强的底物特异性，对其他非天然底物均不具有催化活性。其中，LN07具有较广的底物谱，对(S)-β-homoLys的活性(0.3U/mg)是模板酶3，5-DAHDHcca的540倍，且检测到了对(R）-β-homoMet、(R)-β-homoSer和(S)-3-AHA的微弱活性。 采用坐滴式蒸气扩散法培养3，5-DAHDH蛋白晶体，并于上海同步辐射光源的BL18U1或BL19U1收集X-射线衍射数据。最终解析获得了3，5-DAHDHcca的野生型酶空晶结构(7DL7，2.30(A))、与NADPH结合的复合物结构(7DL3，1.86(A))，及在本实验室前期研究中筛选获得的具有较广底物谱的突变体E310G/A314Y与NADPH的复合物结构(7DL0，2.17(A))。3，5-DAHDHcca的单体由N-端的催化结构域和C-端保守的辅酶结合域组成，NADPH位于二者之间深的裂缝中，这与α-AADHs及天然氨脱氢酶类似。通过观察辅酶结合位点发现，前期研究中影响底物谱的关键位点E310恰好位于活性中心，并与NADPH的酰胺基团形成氢键。一个NADPH由两个亚基所共享的结合模式表明，3，5-DAHDHcca的完整催化功能单元是二聚体，这与单亚基即可完成催化反应的α-AADHs不同。另外，通过晶体结构之间的比较发现，E310G/A314Y·NADPH结构处于“闭合”构象，从而使位于催化结构域的D49和S50通过域间运动分别与NADPH的烟酰胺核糖和焦磷酸基团发生氢键相互作用。 通过量子化学计算和定点突变研究，我们对3，5-DAHDHcca的底物识别及催化机理进行了探究。研究结果表明，氨基酸残基D49、E310和S125分别参与了(3S,5S)-DAH的C3-NH2、C5-NH2和羧基的结合。此外，D49和E310还分别在捕获NADPH烟酰胺核糖的2''-羟基和酰胺基团方面发挥重要作用。该酶催化的氧化脱氨反应主要包括氢负离子转移形成亚胺中间体、水合中间体的形成以及C-N键断裂等步骤，这与α-AADHs的催化机理相似。其中，在水合步骤中，氨基酸残基D177及(3S,5S)-DAH未质子化的C5-NH2均可作为质子受体，在催化反应中活化水分子，这揭示了3，5-DAHDH底物特异性的分子基础。由量子化学计算得出的反应能垒指出，氢负离子转移和C-N键断裂是反应的限速步骤。 以(R)-β-homoMet为模式底物，在具有较广底物谱的突变体E310G基础上，对该酶进行理性设计。通过重新构建NADPH酰胺基团与周围氨基酸的氢键相互作用，并对底物口袋进行改造，最终获得的突变体A179S/E310G/G323S/H328N与E310G相比，对(R)-β-homoMet的催化活性提高了206倍，这比野生型酶活力提高1.8×104倍。底物谱测试结果表明，该突变体还对脂肪族底物(S)-3-AHA、（S)-β-homoLys具有较好的活性，相较于E310G分别提高了110倍和800倍左右。利用已有突变体进一步对另外8种β-氨基酸底物进行筛选及组合突变，最终获得了对(S)-3-AHA、(S)-β-homoLys及(R)-β-Phe活性分别提高285倍、5775倍和11倍的突变体，且最优突变体对底物(S)-β-homoPhe的催化活力可达104mU/mg。底物谱测定结果表明，目前已有突变体对长直链脂肪族底物具有较好活性，但对于短链、支链脂肪族及芳香族底物的活性还比较低。最终，利用优异β-AADH突变体通过不对称还原胺化β-酮酸制备获得了(R)-β-homoMet和(S)-3-AHA，分析产率分别为93％和95％;通过动力学拆分β-氨基酸消旋体，制备获得了光学纯的(S)-β-Phe和(3S)-氨基-3-(4-氟苯基)丙酸，分析产率可达50％，ee值均大于99％。 总之，本研究不仅揭示了3，5-DAHDH的底物识别和催化机理，而且为进一步理性设计新酶实现目标β-氨基酸的不对称合成奠定了坚实的理论基础，开辟了一条绿色合成β-氨基酸及其衍生物的新途径。
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