摘要
微生物源农药具有易降解、不容易污染环境等特点，受到科研工作者的重点关注。本实验室自2013年以来，通过对自然界微生物的不断筛选，最后从青海省平安县感病杨树叶子上分离得到一株对病原微生物具有良好抑制作用的菌株，经菌种鉴定后为出芽短梗霉菌（Aureobacidiumpullulans），并命名菌株编号为PA-2。本试验在此基础上对出芽短梗霉菌PA-2的抑菌次生代谢产物进行研究。 为了明确出芽短梗霉菌PA-2抑菌物质类型，本研究通过原位酸水解-茚三酮显色法对抑菌物质进行定性鉴定，并通过琼脂打孔扩散的方法对其抑菌活性进行测定；为提高出芽短梗霉菌PA-2抑菌物质产量，本实验从转速、温度、装液量、接种量、培养基初始pH五个方面，采用中心组合设计（Centralcompositedesign，CCD）构建响应面法对出芽短梗霉菌PA-2液态发酵培养条件进行优化；为了进一步了解抑菌活性物质的稳定性，本实验从温度、酸碱度、紫外照射、金属离子、有机溶剂、蛋白酶六个方面对抑菌活性物质的稳定性进行了测定，并应用高效液相色谱对粗提物质进行进一步分离纯化。具体试验结果如下： 1.出芽短梗霉菌PA-2抑菌物质鉴定为环状脂肽类物质；该物质对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）、大肠埃希菌（Escherichiacoli）、樱桃球腔菌（Mycosphaerellacerasella）和大麦网斑病菌（Pyrenophorateres）有明显的抑制作用，抑菌圈直径分别为3.65cm、1.95cm、2.15cm、1.35cm、2.18cm。 2.优化后的出芽短梗霉菌PA-2最佳液态发酵条件为：接种量6.85%、转速216.24r·min-1、温度25.80℃、装液量124.87mL、pH7.1。在此条件下模型预测的脂肽类物质产量为0.94g?L?1，实际为0.92g?L?1，比优化前的产量（0.61g?L?1）提高了51%。 3.出芽短梗霉菌PA-2脂肽类物质稳定性测定结果：-80~100℃的环境温度不会对脂肽粗提物的抑菌活性产生影响，121℃左右的高温可以明显降低脂肽粗提物的抑菌活性，失活率为16%。当溶剂pH为3时脂肽粗提物的抑菌活性最强，中性环境会使脂肽粗提物的抑菌活性减弱，碱性环境会使脂肽粗提物的抑菌活性完全消失。8h以内的紫外照射不会对脂肽粗提物的抑菌活性产生影响。Na+、K+、Ca2+、Fe3+四种金属离子对脂肽粗提物的抑菌活性不产生影响。脂肽粗提物完全溶解于甲醇，微溶于乙醇，不溶于乙腈、丙酮和氯仿。胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶对脂肽粗提物的抑菌活性不会造成显著影响。 4.用C18反向分析柱(4.6mm×250mm)，以甲醇和水作为流动相，首次得出最佳分离纯化条件为：甲醇:水=75:25，流速1mL·min-1，进样量20μL，检测波长220nm；用C18反向制备柱(30mm×250mm)对脂肽粗提物进行制备得到5g组分1和1g组分2，组分1对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效果，组分2对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均无抑制效果；用C18反向分析柱(4.6mm×250mm)，以乙腈和水作为流动相，对组分1对应的脂肽物质进行二次纯化，得出最佳分离纯化条件为：乙腈:水=10:90，流速1mL·min-1，进样量20μL，检测波长220nm；用C18反向制备柱(30mm×250mm)对组分1进行制备后得到三个有活性组分，经浓缩干燥后得到3g组分3、1g组分4和0.5g组分5，以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为靶标菌进行抑菌活性测定后，发现组分3、4、5收集的物质对以上俩种菌均有抑制效果，其中组分3对应的物质对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大且最为清晰，抑菌活性最强；脂肽物质对大肠埃希菌的最小抑菌浓度为1.0mg·mL-1，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.5mg·mL-1。
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