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百日咳腺苷酸环化酶毒素重复子毒素域（RTX751）的表达纯化及免疫效果研究
张学1
作者信息
摘要
目的：构建含腺苷酸环化酶毒素(AdenylateCyclaseToxin，ACT)重复子毒素（Repeats-in-toxin，RTX）域(RTX751)和赖氨酸酰基转移酶(Cyclolysinactivatinglysineacyltransferase，CyaC)的双质粒表达系统，表达纯化RTX751蛋白。利用百日咳鲍特菌小鼠气雾感染模型来评价RTX751免疫效果，为研发新一代无细胞百日咳（acellularpertussis，aP）疫苗提供一些思路。 方法：第一部分为表达纯化RTX蛋白。①利用PCR从CS菌株中克隆RTX751(ACT的第751到1706氨基酸残基)基因片段及公司合成CyaC基因片段，②将两个基因分别克隆进pET-28(a)和pCDFDuet-1表达载体，构建pET-28a-RTX751和pCDFDUet-1-CyaC重组表达质粒，并将两个重组质粒转化进同一株大肠杆菌BL21(DE3)。利用镍柱纯化重组RTX751蛋白，获得RTX751蛋白，并进行抗原特异性及乙酰化位点检测。 第二部分为评价RTX751的免疫保护效果。首先用1/40aP+RTX和1/80aP+RTX与1/40aP、1/80aP、RTX、氢氧化铝分别对C57BL小鼠行腹腔两针免疫，间隔21天且每针免疫前进行尾静脉采血分离血清，测百日咳毒素(Pertussistoxin，Pt)、丝状血凝素(Filamentoushemagglutinin，Fha)、百日咳粘附素(Pertussisadhesin，Pm)、RTX抗原的特异性IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平;然后，在第二针免疫后28天用1×1011/CPU/mL对小鼠进行连续30min气雾感染;最后计肺、气管细菌菌落数及细菌清除曲线下总面积（3、7、14、28天），对感染后肺、脾脏组织的IFN-γ，IL-17，IL-5、TNF-α细胞因子进行分析。最后用Grphpadprism7.0软件对结果进行统计分析。 结果：第一部分成功构建双质粒表达系统，且成功表达RTX751蛋白和CyaC蛋白。通过镍柱纯化获得纯度较高的RTX751蛋白，且经WesternBlot检验，蛋白抗原特异性较好。Lys983和Lys860位点未被乙酰化。 第二部分，血清抗体分析表明，1/40aP+RTX组PT、FHA的特异性总IgG水平显著高于1/40aP组(P＜0.01);1/40aP+RTX组PT、FHA、PRN的IgG2a水平显著高于1/40aP组(P＜0.01);1/80aP+RTX组PT、FHA、PRN的特异性总IgG和IgG2a显著高于1/80aP组(P＜0.05);1/80aP+RTX751组PT、PRN的IgG1显著高于1/80aP组(P＜0.01);1/80aP+RTX组RTX的IgG2a显著高于1/40aP+RTX组(P＜0.05);1/80aP+RTX751组PT、FHA的IgG2a/IgG1显著大于1/80aP组(P＜0.01);RTX组RTX的IgG1显著高于Alum组。感染后第7天，1/40aP+RTX组肺部细菌数显著低于1/40aP、1/80aP、1/80aP+RTX组(P＜0.01);与Alum组相比，RTX组呼吸道细菌菌落数无差异（P＞0.05）。细胞因子分析结果表明，RTX加入aP疫苗能降低炎性因子的分泌。 结论：本研究表明在适当剂量的aP疫苗中添加RTX能增强aP疫苗的保护效果。RTX具有较强的免疫原性和佐剂效应，能提高共同免疫抗原的抗体水平，能使aPV诱导的细胞反应类型从Th2向Th1/Th2混合型偏移，对细菌清除具有一定辅助作用。单独的RTX免疫小鼠，虽有一定的抗体产生，但对细菌清除无作用。
关键词
百日咳疫苗/腺苷酸环化酶毒素/重复子毒素域/赖氨酸酰基转移酶/双质粒表达系统/蛋白纯化/免疫效果引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
生物制品学导师
孙明波学位年度
2021学位授予单位
北京协和医学院语种
中文中图分类号
R5