摘要
胃蛋白酶（pepsin）是胃中非常重要的消化蛋白酶，随着我们对核酸消化研究的深入，证实pepsin具有降解核酸的作用，是一种新型的“核酸酶”。前期一系列研究表明pepsin降解核酸与降解蛋白的活性中心密切相关，但其作用机理仍不明确。因此，本文在前期研究的基础上，围绕pepsin消化蛋白的活性中心氨基酸（Asp32和Asp215）选定与其在空间结构上紧密相关的四个氨基酸（S35、G76、T216和T218）进行定点突变，并在酵母细胞中克隆表达，研究突变体对核酸降解的影响，揭示上述四个氨基酸在pepsin消化核酸中的作用，进一步完善胃蛋白酶降解核酸的作用机理。主要内容及结果如下： （1）以含有猪胃蛋白酶原基因的环状重组质粒pPICZαA-PGA为模板，设计引物对PGA基因进行定点突变，阳性克隆鉴定并测序后，获得四个突变猪胃蛋白酶原重组表达载体mPG-S35A、mPG-G76A、mPG-T216A和mPG-T218A。之后将构建成功的重组质粒m-pPICZαA-PGA电转化至巴斯德毕赤酵母X-33中，经阳性克隆筛选、基因组PCR鉴定以及高mRNA表达转化子的qPCR筛选，得到高表达转化子，在YPD、BMGY、BMMY培养基中培养表达获得含有突变酶原的表达液。SDS-PAGE电泳测定表达酶原的分子量，酶原经pH2.0的缓冲液激活后进行酶活分析，结果显示经酵母细胞表达获得的猪胃蛋白酶原突变体的分子量与预期一致，约48kDa，且以血红蛋白为底物测定的酶活力在6.6-15.6U/mL之间，表明四种酶原突变体在酵母中获得成功表达。 （2）突变酶原的表达液以60%硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseFF阴离子交换柱和Hiprep16/60sephacrylS-200H凝胶柱纯化，各个纯化阶段的突变酶原以牛血清蛋白为标准品测定浓度，通过SDS-PAGE和HPLC分析其纯度，激活后以血红蛋白为底物测定其消化蛋白的酶活力。最终纯化获得的四种突变猪胃蛋白酶原的纯度在95%左右，总蛋白产量在5.8-9.8mg/L之间。以血红蛋白评价的其总酶活为943-3688U，比活力在162.6-376.3U/mg之间。不同位点的突变会降低酶的活性，其中76位甘氨酸突变为丙氨酸后的突变酶原降解蛋白的活力与野生型猪胃蛋白酶最接近，可达15%；216位苏氨酸与218位苏氨酸突变后对pepsin降解蛋白的影响次之；第35位丝氨酸突变成丙氨酸对pepsin消化蛋白的影响最大，酶活下降至6.5%。 （3）以pH2.0的盐酸缓冲液激活克隆获得的四种猪胃蛋白酶原突变体，以双链λDNA和单链41nt、59ntDNA为底物研究四种变体降解核酸的异同，并与原始猪胃蛋白酶的消化作用进行比较。结果显示，35位丝氨酸可能对pepsin与双链核酸底物的结合有重要作用，76位甘氨酸可能对胃蛋白酶与单链核酸底物的结合有重要作用，而216位苏氨酸对单链和双链核酸的降解皆有重要作用，是pepsin降解核酸的活性中心关键氨基酸。 综上所述，本研究构建了四种新型的猪胃蛋白酶原突变体，实现了其在毕赤酵母X-33中的高效表达，并获得了纯度较高的目的酶原，通过四种突变体对不同核酸降解的研究，再次确定了一个降解核酸的关键氨基酸，为进一步解析胃蛋白酶降解核酸的机理提供支持。
NETL