摘要
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称白脚虾、南美白对虾，原产于中南美洲太平洋沿岸的温暖水域，自1988年引进我国之后，快速在沿海和内陆淡水水域推广，养殖范围广泛。因其生长速度快，环境适应能力强，经济效益高等特点，在我国对虾养殖产业中所占比重越来越高。据统计2012年全国凡纳滨对虾产量达到145万吨,占对虾养殖总产量的85%。然而，近年来随着凡纳滨对虾集约化养殖程度越来越高，养殖环境日益恶化，对虾自身免疫力下降、病害频发、药物滥用及药物残留所导致的问题日渐突出，制约了我国对虾产业的绿色健康可持续发展。目前，面对养殖中出现的病害、食品安全及提高对虾免疫力等问题，找到一些绿色环保、安全高效的化学药物替代品至关重要。 免疫增强剂因具有绿色、高效、无残留、开发成本低、应用范围广泛、使用安全方便等特点，越来越受到国际养殖业的关注，成为了水产保护学研究的焦点。免疫调节蛋白作为免疫增强剂的一种，有研究表明免疫调节蛋白酶体不仅可以更好地处理抗原，保持细胞蛋白质的稳态，并且对于调节炎症因子的分泌、细胞增殖分化、抗氧化、抗应激和维持细胞蛋白质的稳态具有很大的作用。本研究以凡纳滨对虾为研究对象，研究了免疫调节蛋白不同使用剂量、方式及频率对其生长、血清非特异性、免疫抗病力及免疫基因表达的影响，还有免疫调节蛋白不同使用频率对对虾肠道菌群结构的影响，来为其将来在凡纳滨对虾养殖上的使用提供科学指导。 1.不同剂量免疫调节蛋白对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫、抗病力及免疫能力的影响 以初体重为（3.79±0.13）g的凡纳滨对虾为实验对象，研究了饲料中添加不同浓度免疫调节蛋白（1、5、10、20mg/kg）对凡纳滨对虾的生长、血清非特异性免疫、抗病力及免疫基因相对表达量的影响。每个处理组分别设5个重复，试验周期为42天。养殖实验结束后，采取以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）注射攻毒法进行攻毒实验，实验周期15天。实验结果表明：（1）各处理组对虾的成活率均在80%以上，各组间无显著差异。与对照组相比，除1mg/kg处理组外，其余各组对虾的末体重、特定生长率、饲料效率均显著提高（Plt;0.05）。（2）副溶血弧菌攻毒实验显示，所有处理组对虾累计死亡率均显著低于对照组67%，其中20mg/kg处理组累计死亡率为0。（3）20mg/kg处理组对虾血清超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活性均显著高于对照组和其他处理组（Plt;0.05），而1mg/kg添加水平下，血清中超氧化物歧化酶、溶菌酶和诱导型一氧化氮合酶活性显著高于对照组和其他处理组（Plt;0.05）。（4）对虾肝胰腺的Toll和IMD免疫基因相对表达量，与对照组相比1、20mg/kg处理组免疫基因相对表达量显著升高（Plt;0.05）。综上所述，饲料中合理添加免疫调节蛋白可有效促进凡纳滨对虾的生长，增强对虾血清非特异性免疫能力和对副溶血弧菌的抗病力水平。以免疫力水平和抗病力为评价指标，免疫调节蛋白的适宜添加量为20mg/kg。 2.免疫调节蛋白不同使用方式对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫、抗病力及免疫能力的影响 以初体重为（3.79±0.13）g的凡纳滨对虾为实验对象，研究了免疫调节蛋白不同使用方式对凡纳滨对虾的生长、血清非特异性免疫指标、抗病力及免疫基因相对表达量指标的影响。实验一共设置3个处理组，分别为持续投喂剂量10mg/kg饲料（T3）；间歇投喂剂量10mg/kg饲料，使用5天、停用5天（T6）；间歇泼洒剂量0.5mg/kg免疫调节蛋白，使用5天、停用5天（P1）；对照：基础饲料（DZ）。每个处理组分别设5个重复，试验周期为42天。养殖实验结束后，采取注射攻毒法以副溶血弧菌进行攻毒实验，实验周期15天。实验结果表明：（1）各处理组对虾的成活率均在80%以上，各组间无显著差异。与对照组相比，除使用5天、停用5天处理组外，其余各组对虾的末体重、特定生长率、饲料效率均显著提高（Plt;0.05）。（2）免疫调节蛋白在以10mg/kg剂量连续投喂和间歇投喂（5天使用、5天停用间歇使用）下均可显著提高凡纳滨对虾的抗病力，间歇使用的抗病效果优于连续使用。但间歇泼洒没有体现出抗病效果，且使用量较大。（3）不同使用方式免疫调节蛋白对虾血清非特异免疫酶活性有所差异，泼洒方式下部分非特异免疫酶活性提高作用似乎优于投喂。但不同使用方式对血清碱性磷酸酶和血清诱导型一氧化氮合酶活性没有显著影响。（4）凡纳滨对虾肝胰腺Toll和IMD信号通路相关免疫基因表达量均显著升高（Plt;0.05），但间歇泼洒与对照组相比差异不大或低于对照。综上所述，三种免疫调节蛋白使用方式都可有效促进凡纳滨对虾的生长，增强对虾血清非特异性免疫能力和对副溶血弧菌的抗病力水平。若以提高对虾免疫力及抗病力水平为评价指标免疫调节蛋白以5天使用、5天停用间歇投喂的方式使用，效果较好。 3.免疫调节蛋白不同使用频率对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫、抗病力及免疫能力的影响 以初体重为（3.79±0.13）g的凡纳滨对虾为实验对象，研究了免疫调节蛋白不同使用频率对凡纳滨对虾的生长、血清非特异性免疫指标、免疫基因相对表达量指标及抗病力的影响。设置4个处理组，分别为连续投喂（T3）；间歇投喂使用3天，停用3天（T5）；间歇投喂使用天5，停用5天（T6）；间歇投喂使用7天，间歇投喂停用7天（T7）；剂量都为10mg/kg；对照：基础饲料（DZ）。每个处理组分别设5个重复，试验周期为42天。养殖实验结束后，采取注射攻毒法以副溶血弧菌进行攻毒实验，实验周期15天。实验结果表明：（1）各处理组对虾的成活率均在80%以上，各组间无显著差异。与对照组相比，除使用5天、停用5天处理组外，其余各组对虾的末体重、特定生长率、饲料效率均显著提高（Plt;0.05）。（2）副溶血弧菌攻毒实验显示，各间歇投喂处理组对虾死亡率均显著降低（Plt;0.05）。其中，间歇投喂效果要优于连续投喂，尤其以使用5天、停用5天的效果最佳。（3）不同投喂频率免疫调节蛋白对虾血清不同非特异免疫酶活性有所差异。但在10mg/kg剂量下，不同投喂频率对血清SOD、AKP和iNOS活性没有显著影响。（4）从Toll和IMD免疫基因相对表达量来看除了使用3天、停用3天处理IMD信号通路相关免疫基因表达量，其他投喂频率下凡纳滨对虾肝胰腺Toll和IMD免疫基因表达量均显著升高（Plt;0.05）。综上所述，四种免疫调节蛋白使用频率都可有效促进凡纳滨对虾的生长，增强对虾血清非特异性免疫能力和对副溶血弧菌的抗病力水平。以促进凡纳滨对虾的生长，提高凡纳滨对虾免疫力为目标，免疫调节蛋白使用频率以10mg/kg连续投喂的方式使用，效果较好。如果以提高抗病力为目标，以使用5天、停用5天的效果最佳。 4.免疫调节蛋白的添加频率对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响 通过对凡纳滨对虾以不同频率投喂含有免疫调节蛋白的对虾饲料，研究了免疫调节蛋白不同使用频率对凡纳滨对虾肠道菌群结构和多样性的影响。通过肠道菌群的16S rRNA高通量测序和生物信息学分析表明：（1）基于97%相似性水平划分OTUs的稀释曲线分析，各个样品的序列达到40000条以上时，OTUs的数量上升趋于平缓，表明样品的序列测序数量可以有效覆盖文库；测序覆盖深度（Coverage）均达到0.999，说明样品中序列未被测到的概率较低，能真实反映样品中微生物实际组成情况。（2）在统计了用来反映群落物种丰度的Ace、Chao指数，以及用来反应物种丰富度和均匀度的Shannon指数之后发现，指数显示间歇投喂组（喂五天，停五天）肠道菌群多样性较高。（3）在门水平下分析对虾肠道菌群相对丰度后发现，对照组和处理组优势菌门均为变形菌门、拟杆菌门。在属水平可以看出弧菌属的相对丰度，T3、T6组都明显降低，免疫调节蛋白对弧菌有明显抑制作用。（4）PCoA和NMDS分析都显示各处理组对虾肠道菌群结构有所差异，T3、T6处理组对虾肠道菌群结构与对照组对虾肠道菌群结构差异明显，但T3、T6组两组之间差异不明显。Network分析图显示对照组相比，间歇添加免疫调节蛋白组，物种间关系更加复杂、结合更加紧密、核心物种数明显增加。
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