摘要
SOX（SRYrelatedHMG-box）家族成员作为转录因子参与调控多种生物学功能。SOX2、SOX9、SOX17是SOX家族的重要成员，它们在脊椎动物细胞干性的维持，性别决定与分化以及精子发生中发挥重要作用，且功能存在一定的物种间差异。在无脊椎动物中，上述基因的表达和功能尚不清楚。本研究以海洋经济贝类栉孔扇贝(Chlamysfarreri)作为研究对象，以sox2、sox9、sox17为目标基因；RACE扩增它们的全长cDNA序列，并进行序列特征分析；原位杂交和免疫组化技术确定它们在栉孔扇贝年周期发育性腺中的细胞学定位；进一步，通过RNAi敲降生长期栉孔扇贝精巢中的sox2表达水平，研究了其在精子发生过程中的作用，并在转录组水平分析了sox2调控精子发生可能的基因通路。主要结果如下： 定量RT-PCR结果显示，栉孔扇贝sox2（Cf-sox2）的表达量随精巢发育逐渐升高，成熟期精巢中的表达量是增殖期精巢的4倍。原位杂交结果显示，Cf-sox2mRNA定位在精巢的所有生殖细胞（精原细胞、精母细胞、精细胞和精子）中。闭壳肌注射Cf-sox2-dsRNA，定量RT-PCR检测注射后第3d扇贝精巢中的Cf-sox2表达水平较空白对照组下降了65%；组织学检测发现，Cf-sox2的表达下降致使扇贝精巢生殖管泡中的生殖细胞数量大量减少，至第21d的精巢生殖管泡接近空泡状，管壁上仅残留少量精原细胞；TUNEL检测结果显示，许多精母细胞呈现细胞凋亡信号；表明Cf-sox2在栉孔扇贝精子发生过程中发挥重要的作用。进一步，本实验选择Cf-sox2mRNA敲减第3d精巢和空白对照组精巢各3个样本进行了转录组分析，共获得263,383,562条cleanreads，131,340条unigenes和2,067个差异表达基因。KEGG通路富集分析结果显示，这些差异表达基因在癌症通路、剪接体通路以及病毒引起的癌变通路中富集最多，在凋亡通路和TNF信号通路中富集到多个与细胞凋亡和抗凋亡相关的差异基因。GO功能富集分析结果发现，许多差异表达基因是一些涉及细胞凋亡（casp2、casp3、casp8）、细胞增殖（samd9、crebzf、iqsec1、bmp7）、生精细胞发育（htt、tusc3）相关的基因。由此提出sox2mRNA的敲降导致生精细胞发育和增殖相关基因异常表达，同时激活凋亡通路，进而导致精子发生受阻。 栉孔扇贝sox9（Cf-sox9）全长cDNA序列为2,835bp，开放阅读框为1,413bp，编码470个氨基酸。预测的氨基酸序列具有SOX家族的HMG-box和SOXE亚族的高度保守区域，但没有脊椎动物羧基端的Pro-Gln-Serrich区域。根据Cf-sox9全长cDNA序列，制备了Cf-sox9地高辛标记的RNA探针和Cf-SOX9多克隆抗体；采用原位杂交和免疫组织化学技术确定Cf-sox9转录本和Cf-SOX9蛋白均定位在栉孔扇贝精巢和卵巢的所有生殖细胞中。这一表达特征与脊椎动物性腺中多样的性别差异表达特征不同，由此推测Cf-sox9可能参与了栉孔扇贝配子发生过程，该基因的功能可能随物种进化逐渐特化。 栉孔扇贝sox17（Cf-sox17）的全长cDNA序列为2,802bp，开放阅读框为1,536bp，编码511个氨基酸。预测的氨基酸序列具有SOX家族的HMG-box，且与SOXF亚家族中SOX17的HMG-box一致性最高，但缺少脊椎动物SOX17羧基端的高保守区域。根据Cf-sox17全长cDNA序列制备了Cf-sox17地高辛标记的RNA探针和Cf-SOX17多克隆抗体；采用原位杂交和免疫组织化学技术确定Cf-sox17转录本和Cf-SOX17蛋白均定位在栉孔扇贝精巢和卵巢的所有生殖细胞中，这与脊椎动物sox17在性腺中非所有细胞表达的特征不同。由此，推测Cf-sox17不仅参与了栉孔扇贝的精子发生，也参与了栉孔扇贝的卵子发生。
NETL