摘要
猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的消化道疾病。主要危害新生仔猪，其致死率高达90％。由于新生仔猪肠道黏膜先天性免疫水平较低，PEDV感染后造成其肠绒毛的萎缩和大量脱落，导致新生仔猪出现急性的脱水或营养障碍性死亡。因此如何缓解PEDV造成的急性肠道损伤，是有效降低PEDV感染引起仔猪高死亡率的关键。 在本实验室前期研究中，我们发现，PEDV感染能够显著促进上皮细胞分泌白细胞介素11(Interleukin-11，IL-11)。作为一种经典的抗炎因子，IL-11在肠道黏膜屏障的维护中扮演着重要作用，其能在多种原因造成的肠道损伤中，发挥抗凋亡、促增殖和抑制炎症反应等保护作用。但IL-11在病毒感染所引起的肠道损伤中的功能尚不清楚，其是否能够缓解PEDV的所造成的肠道损伤，值得进一步研究。围绕这一科学问题，本研究首先结合体内外试验探究了PEDV感染对仔猪上皮细胞IL-11分泌的影响，然后通过原核表达获取重组IL-11，并结合RNA干扰技术，初步探究了IL-11对病毒的抑制作用及具体机制，发现IL-11通过激活STAT3信号通路可以阻断PEDV诱导的细胞凋亡，从而维护肠上皮细胞结构。具体研究内容分为以下两个部分: 1.PEDV感染对肠上皮细胞分泌IL-11的影响 为了研究PEDV感染对上皮细胞IL-11基因转录及蛋白表达的情况，我们通过荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，RT-qPCR)和蛋白印迹法(Westernblot，WB)对PEDV感染后上皮细胞中IL-11的mRNA和蛋白含量进行了检测，发现上皮细胞中IL-11无论是mRNA转录水平还是蛋白的表达水平和对照组相比均显著增多（*P＜0.05）;进一步我们还通过酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)对上清液中IL-11蛋白水平进行了检测，发现病毒感染后上清液中IL-11的分泌量也显著增加（*P＜0.05)。上述试验说明PEDV在感染上皮细胞后能引起IL-11的表达和分泌水平的升高。 为进一步验证体外试验结果，我们进行了动物试验，仔猪口服PEDV54h后出现严重水样腹泻和呕吐，剖检后可见典型PED症状:仔猪小肠肠壁厚度变薄且变得透明，肠腔中积累了大量的液体，空肠充血，肠绒毛出现多灶性弥漫性萎缩。免疫组化检测显示大量PEDV存在于小肠上皮细胞中。进一步我们采用RT-qPCR和ELISA对仔猪肠道中IL-11的表达进行了检测，发现肠道中IL-11mRNA和蛋白水平的表达均增加。最后我们对PEDV感染水平与IL-11表达量进行了相关性分析，结果显示无论是在上皮还是在肠道中PEDV感染均可引起IL-11表达增加。因此IL-11可能在PEDV感染肠上皮细胞中具有重要作用，其潜在功能值得进一步探究。 2.IL-11在PEDV感染中的作用及机制初探 我们以猪小肠提取的cDNA为模板扩增猪IL-11，将其构建至pET-32a(+)原核表达质粒，获得pET-32a(+)-pIL-11重组质粒。经过纯化获得纯度为95％的重组猪白介素11(pIL-11)。随后我们使用pIL-11预处理上皮细胞，然后感染PEDV，通过Westernblot和空斑试验检测病毒复制水平，发现pIL-11对PEDV的感染具有抑制作用。进一步我们通过shRNA干扰抑制了肠上皮细胞中IL-11的转录，结果显示，IL-11敲低细胞中PEDV的复制水平明显高于对照组，而在IL-11干扰的细胞培养基中再次添加IL-11，PEDV的复制水平同样受到明显抑制，上述试验结果表明IL-11能够拮抗PEDV感染。 为探究IL-11抑制PEDV的具体机制，我们使用不同浓度的pIL-11处理VeroE6细胞后，我们对IL-11受体下游经典通路的激活进行了研究，发现IL-11能够明引起Akt(Ser473)和STAT3(Ser727和Tyr705)的磷酸化。随后我们使用细胞通路抑制剂处理，发现只有STAT3通路被抑制后，IL-11抗病毒的能力显著下降，这说明IL-11激活了VeroE6细胞中IL-11/STAT3信号通路，最终提高了其抗病毒作用的能力。进一步通过流式细胞术检测，发现IL-11能够明显抑制PEDV引起的细胞凋亡，而当使用STAT3抑制剂处理后，IL-11的抗凋亡作用受到明显抑制。因此我们认为IL-11可能通过刺激IL-11/IL-11R/STAT3通路，调控凋亡相关基因的表达，从而抑制病毒复制。本研究探究了IL-11对PEDV引起新生仔猪肠道细胞凋亡的保护作用，为IL-11在防控PEDV等肠道病原中的应用奠定了理论基础。
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