摘要
分子流行病学(Molecularepidemiology)是利用相对先进的技术测定生物学标志的分布情况，结合流行病学研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的流行病学特征。快速的分子流行病学调查可以帮助我们迅速将流行菌株进行分型分析，进而了解菌株的流行特征，对于疾病的防治具有重要意义。相对传统的分子流行病学分析方法有多位点序列(MLST)分型、系统进化群分群、毒力基因检测以及分子血清型分型;与此同时，MALDI-TOFMS作为一种新型的细菌鉴定方法在近几年迅速发展起来，并有越来越多的研究表明MALDI-TOFMS可能会成为新型的、快速的细菌分型工具。现阶段MALDI-TOFMS在大肠杆菌鉴定方面已经比较成熟，鉴定结果可靠，但其在兽医领域运用较少，运用于鸭疫里氏杆菌的鉴定则更少，导致质谱自建库不完善，鉴定结果准确率较低。本文就水禽养殖产业中两种重要的细菌—禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiaColi,APEC)和鸭疫里氏杆菌（Rimerellaanatipestifer，RA）展开研究，一方面应用传统分子流行病学研究方法对禽致病性大肠杆菌分离株进行分子流行病学调查，为APEC的防控提供重要的参考价值;另一方面，将MALDI-TOFMS运用于鸭疫里氏杆菌，运用R分析其原始下机数据（荷质比、离子强度），从而建立鸭疫里氏杆菌质谱鉴定方法，并尝试探索其与血清型之间的关系。 1.禽致病性大肠杆菌分子流行病学调查 禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiaColi,APEC)是禽大肠杆菌病的病原，可使发病禽产生败血症、腹膜炎、气囊炎、输卵管炎、肿头综合症等症状甚至死亡，严重危害禽养殖业健康。随着抗生素乱用滥用，APEC耐药性逐渐增强，给APEC的防控带来困难。2019年2月到2019年9月期间，从江苏及周边地区水禽养殖场收集病料，分离得到104株APEC，为研究在此期间APEC的流行病学特征，本研究对其进行了分子流行病学调查，可对APEC的防控提供重要的参考价值。 为了清楚地了解其流行状况，首先对104株APEC进行多位点序列(MLST)分型，对APEC的七个管家基因(adkfumC,gyrB,icd,mdh,purA，recA)进行测序及比对分析，分型结果显示:优势流行的ST序列型为ST23，为32株(30.8％)，ST2505和ST117，分别为18株(17.3％)和13株(12.5％)，ST224为9株(8.7％)，ST155为6株(5.8％)，ST156、ST602和ST2085均为2株(1.9％)，ST648、ST949、ST227、ST3967、ST48、T349、ST10、ST383、ST140均为1株(0.96％)。另外，发现11株APEC为新ST型，占10.6％。结果表明江苏及周边地区在此时期流行APEC的优势ST型为ST23、ST2505、ST117、ST224及ST155，其中ST23型流行最多;然后，采用分子分群方法对APEC进行系统进化群分群，用PCR方法检测大肠杆菌chuA基因、yiaA基因和DNA片段TspE4.C2的有无，将大肠杆菌分为A、B1、B2和D群。结果显示，在分离的104株APEC，A群有56株，占53.8％，B1群有21株，占20.2％，B2群有3株，占2.9％，D群有24株，占23.1％。结果表明江苏及周边地区流行APEC以A群为优势进化群;其次，为了了解分离菌株中毒力基因的分布情况，选择了9种具有代表性的APEC毒力基因进行PCR检测。这9种毒力基因包括毒素基因(astA)，空泡形成素基因(vat)，溶血素基因(hlyF)，血清抗性蛋白基因(cvi/cva、iss)，温度敏感血凝素基因(tsh)，黏附素基因(papC)，耶尔森强毒力岛基因(irp2)，铁离子摄取系统基因(iroN)。结果表明104株APEC毒力基因的携带情况为:astA基因15.4％，vat基因18.3％，hlyF基因97.1％，cvi/cva基因89.4％，tsh基因70.2％，iss基因97.1％，papC基因7.7％，irp2基因68.3％，iroN基因94.2％;最后，作为补充的流行病学数据，根据其中21株APEC的全基因组测序结果，对其wzx，wzy基因与数据库对比进行血清型O抗原分析发现存在除O1、O2、O78三种常见血清型以外的其他血清型，比如:O9、O29、O33、O83、O145，提示APEC流行菌株血清型多且复杂。 2.水禽细菌病质谱鉴定方法的建立 鸭疫里氏杆菌(Rimerellaanatipestifer，RA)为传染性浆膜炎的病原，主要危害鹅和鸭，是极具危害性的细菌病原之一。鸭疫里氏杆菌的分离鉴定在临床上及流行病学调查方面调查研究都非常重要，但是传统的检测方法不仅浪费时间而且消耗人力;而近年来一种新型的检测技术-MALDI-TOFMS（激光解吸附飞行时间质谱）正逐渐取代传统的细菌检测方法，相比传统细菌检测方法，MALDI-TOFMS具有诸多优势，使得细菌检测变得高效和准确。但MALDI-TOFMS目前在兽医领域运用较少，运用于鸭疫里氏杆菌的鉴定则更少。因此，将MALDI-TOFMS运用于鸭疫里氏杆菌，寻找鸭疫里氏杆菌的特征质谱峰，对于质谱细菌鉴定法的建立有重要意义。本研究采用梅里埃的VITEK质谱仪分别对16株鸭疫里氏杆菌、8株沙门氏菌、8株猪链球菌、8株大肠杆菌进行了激光解吸附飞行时间质谱，并利用R（版本3.6.2）分析其原始峰度数据，最终找到8个属于鸭疫里氏杆菌的可以帮助鉴定特征峰。此外，为了探索MALDI-TOFMS鉴定血清型的可能性，将常见优势血清型1型和2型菌株的特征峰进行比较，发现在这些特征峰存在一些规律性特征，这些特征可能有助于我们利用质谱鉴定其血清型。
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