摘要
牙周炎作为一种不可逆的慢性进行性疾病，是成年人牙齿脱落的主要原因之一。牙周健康状态到牙周炎转变的过程中，口腔微生物群落结构也发生了重要变化。近期研究表明，口腔微生物在影响口腔局部环境以及全身系统的同时，全身系统也在影响着口腔微生物的群落结构。然而，目前诸多关于牙周炎与口腔微生物的队列研究中，对于全身系统因素的干扰并未给予重视。 目的： 研究排除全身系统因素和局部因素的前提下，不同牙周状态之间口腔微生物群落群落构成变化以及口腔微生物群落的功能分析。 方法： 于2019.7至2019.11年在郑州大学第一附属医院体检中心收集566受试者唾液样本，并对受试者进行口腔全科检查和基本信息调查。根据纳入排除标准，最终确定112人入组，包括61位牙周健康人，30位Ⅰ&Ⅱ期牙周炎患者和21位Ⅲ&Ⅳ期牙周炎患者。 1.通过16SrRNA技术检测不同人群口腔菌群的变化 在受试者的基本信息的差异分析中，连续变量的差异采用独立T检验，分类变量的差异采用卡方检验。根据秩和检验对OTUs的分析结果，采用样本序列的随机抽样。采用基于OTUs的Brary-Curtis距离进行非参数多源方差分析（Permutationalmultivariateanalysisofvariance，PERMANOVA）分析，分析造成组间差异的因素。用R程序包vegan进行计算，Shannon指数和ObservedSpecies(Obs)指数显示细菌alpha多样性。基于Bray-Curtis距离矩阵，通过R软件包进行主坐标分析（PrincipalCoordinatesAnalysis，PCoA）可视化，显示队列间微生物群落的beta多样性差异。采用线性判别分析效果大小（LineardiscriminantanalysisEffectSize，LEfSe）分析，用于在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标识(Biomarker)。通过Spearman相关系数(Spearman''srankcorrelationcoefficient)，将受试对象的临床指标数据（如年龄、BMI、抽烟等）与差异菌群相对丰度进行关联分析。 2.基于测序数据，通过PICRUSt预测功能差异。 结合京都基因组数据库(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)进行同源性分析，利用未观测状态重建的群落系统发育研究（PhylogeneticInvestigationofCommunitiesbyReconstructionofUnobservedStates，PICRUSt）获取微生物组与基因功能的注释结果，然后使用秩和检验进行差异分析，比较不同分组之间微生物组基因功能的差异。 结果： 1.统计学分析结果显示，性别、年龄、BMI、饮食习惯、吸烟情况、饮酒情况、每日刷牙次数、牙线使用和错牙合畸形等信息在各分组间没有无显著差异(P＞0.05)。 2.慢性牙周炎组与牙周健康组唾液菌群丰富度排名前五的菌门均为厚壁菌门（Firmicutes），拟杆菌门(Bacteroidetes)，变形菌门(Proteobacteria)，放线菌门(Actinobacteria)，梭菌门(Fusobacteria)。 3.采用PERMANOVA的多因素分析结果显示，在慢性牙周炎组和牙周健康组的基本信息中，分组对菌群结果有显著影响(P＜0.05)，而其它基本信息对菌群结构是没有显著影响的(P＞0.05)。此外，在Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组与Ⅲ&Ⅳ期牙周炎组的基本信息中，所有的基本信息对菌群结构均没有产生显著的影响(P＞0.05)。 4.牙周健康组与慢性牙周炎组之间的唾液菌群alpha多样性无显著差异(P＞0.05)，牙周健康组与慢性牙周炎组之间唾液菌群的beta多样性差异显著(P＜0.05);不同分期慢性牙周炎组之间的唾液菌群alpha多样性和beta多样性均无显著差异（P均＞0.05）。 5.LEfSe分析结果显示，16个属在慢性牙周炎组和牙周健康对照组之间存在显著差异。15个属在慢性牙周炎组中富集，包括双歧杆菌属（Bifidobacterium），链杆菌属（Streptobacillus），坦纳菌属（Tannerella），密螺旋体属（Treponema），拟杆菌属(Bacteroides)，乳杆菌属（Lactobacillus），乳球菌属（Lactococcus），颤螺菌属（Oscillibacter），月形单胞菌属（Selenomonas），Barnesiella,Coprobacter,Parabacteroides,Flavonifractor,Parasutterella，Senegalimassilia。此外，嗜血杆菌（Haemophilus）在牙周健康组中富集(LDA＞2)。Spearman相关分析结果显示，三种在慢性牙周炎组富集的细菌，包括乳酸菌，双歧杆菌和Flavonifractor，与受试者特征呈正相关（例如，错牙合畸形和牙线使用情况）;富集在慢性牙周炎组的月形单胞菌属和密螺旋体属分别与性别和牙线使用情况呈显著负相关;富集在牙周健康组的嗜血杆菌属与牙线使用情况呈显著负相关。 LEfSe分析显示，4个属在Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组和Ⅲ&Ⅳ期牙周炎组之间存在显著差异。Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组中富集的细菌包括棒状杆菌（Corynebacterium），链球菌（Streptobacillus）和食物谷菌属（Victivallis）三个属。Eggerthella在Ⅲ&Ⅳ期牙周炎组中富集(LDA＞2)。Spearman相关分析结果显示，富集于Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组中的链球菌与日常刷牙次数呈正相关，Victivallis与年龄呈负相关。 6.KEGG同源分析(KEGGOrthology，KO)分析结果显示，慢性牙周炎患者与牙周健康对照之间存在差异功能基因共171种，其中存在显著差异的功能基因有50种(P＜0.025)，34种在慢性牙周炎组中富集;同时，我们发现有25种功能酶在Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组和Ⅲ&Ⅳ期牙周炎组间存在差异。其中存在显著差异的功能酶有6种(P＜0.025)，5种在Ⅰ&Ⅱ期牙周炎组中富集，1种在Ⅲ&Ⅳ期牙周炎组间富集。 结论： 本项研究表明，在排除目前常见的全身系统因素和局部因素的前提下，牙周健康队列与慢性牙周炎队列的唾液样本中微生物群落以及功能基因发生了显著变化，而不同程度牙周炎队列之间的唾液样本中微生物群落以及功能基因并未发生显著变化。
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