摘要
柑橘大实蝇Bactroceraminax是我国柑橘类果树上的重要害虫。成虫产卵于橘果实，严重影响了柑橘的产量和质量。物理防治耗时且成本高，农业防治缺少劳动力，化学防治容易造成农药“3R”问题。因此，研发新型、高效、绿色的柑橘大实蝇防治方法很有必要。众所周知，利用嗅觉来诱捕害虫是一个高效、环保的防治策略。气味结合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)是昆虫嗅觉通讯中的关键蛋白，它可以结合脂溶性的气味分子并运输其通过感器淋巴液到嗅觉受体，进而引发相应的嗅觉行为。昆虫气味结合蛋白是害虫防治的潜在靶标，针对这一靶标可以开发环境友好的防治策略。然而，柑橘大实蝇气味结合蛋白的研究却很少。本课题通过柑橘大实蝇头部转录组得到7个OBP基因（BminOBP1-BminOBP7），并分析了这些基因的生物信息学和组织表达模式。根据组织表达模式，我们对在触角高表达的BminOBP3和BminOBP6进行了原核表达、蛋白纯化，得到了这2个基因的异源表达蛋白，利用荧光竞争结合实验，分析了BminOBP3和BminOBP6与13种气味化合物的结合能力。获得主要研究结果如下： 1.BminOBPs序列分析 通过搜索柑橘大实蝇头部转录组数据，得到7个潜在的OBPs基因，分别命名为BminOBP1-BminOBP7，7个OBPs都属于ClassicOBPs亚家族，多序列比对显示7个OBPs含有ClassicOBPs典型特征：高度保守的6个半胱氨酸，而且，7个OBPs都能在进化树上找到与其同源的其他双翅目昆虫OBPs。 2.BminOBPs组织表达分析 通过荧光实时定量PCR分析了BminOBP1-BminOBP7在柑橘大实蝇成虫不同组织中的分布情况。结果发现，BminOBP3和BminOBP6主要在触角中高表达。在头部，BminOBP1显著高表达。BminOBP7高表达于翅。BminOBP2在头、足、翅三个组织中高表达。BminOBP4主要在雄虫腹部表达。BminOBP5在触角和足中显著高表达。BminOBPs组织表达差异，表明BminOBPs除了嗅觉功能可能还有味觉功能和其他的生理功能。 3.BminOBP3和BminOBP6基因克隆、原核表达和蛋白纯化 采用异源表达方式，成功构建了BminOBP3和BminOBP6基因的克隆载体（pGEM-T/BminOBP3,pGEM-T/BminOBP6）和表达载体（pET-32a/BminOBP3和pET-32a/BminOBP6），经过诱导表达、纯化、肠激酶酶切，最终得到纯度较高的异源表达的目的蛋白BminOBP3和BminOBP6。这为后续这2个蛋白的功能研究提供了分子基础。 4.BminOBP3和BminOBP6的结合特性分析 使用荧光探针1-NPN，通过荧光竞争结合方法分析了BminOBP3和BminOBP6同13种挥发物的亲和性。结果表明，BminOBP3只与13种挥发物中的十一醇有较强的结合能力，Ki为11.397μM。BminOBP6与13种挥发物中3种气味化合物结合，其中与柠檬烯和十一醇结合能力很强，Ki分别为：7.373μM、8.098μM，与戊醛结合能力稍弱，Ki为：16.186μM。
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