摘要
目的：DNAJB6是近年新发现的肌原纤维性肌病（myofibrillarmyopathies，MFMs）的致病基因，其编码的蛋白质以DNAJB6a和DNAJB6b两种亚型存在于有核细胞内，具有清除异常蛋白、维持细胞内稳态的功能。既往研究表明，DNAJB6b是DNAJB6相关MFMs的责任蛋白，DNAJB6a在MFMs发生发展中的功能意义尚不清楚。本团队于一MFM患者的基因检测结果中发现DNAJB6纯合新突变c.695_699del（p.V232Gfs*7），该突变位于9号外显子，仅导致DNAJB6a亚型C端氨基酸合成提前终止，不直接影响DNAJB6b的编码。因此，我们提出假设：该新突变通过影响DNAJB6a的功能导致MFMs发生。为证明该假设，本研究拟结合生物信息学、细胞生物学、分子生物学和基因工程技术，展开临床、在体动物及体外细胞三个层面的研究，以明确该突变在MFMs发生发展中的功能，并初探其作用机制，为DNAJB6相关MFMs精准诊疗提供创新的科学依据。 本研究包括三个部分： 第一部分：DNAJB6新纯合突变在一肌原纤维性肌病患者家系中的临床研究 方法：全面筛查该MFM患者家系成员的临床资料，并完成家系成员外周血标本DNAJB6一代测序，依据ACMG指南及生物信息学软件预测突变位点的致病性；同时，利用免疫荧光染色、q-PCR及WesternBlot等方法，检测先证者骨骼肌组织的DNAJB6及其相关蛋白（Desmin、TDP-43、LC3B，p62和Dysferlin蛋白）在细胞中的分布与水平。 结果：先证者家系中仅先证者存在MFMs的临床表型和DNAJB6c.695_699del纯合突变。与正常对照者相比，先证者肌组织细胞DNAJB6蛋白在细胞核内表达缺失、在细胞膜下及细胞质中异常聚积。同时，Desmin、TDP-43、LC3B，p62和Dysferlin蛋白在细胞质中异常聚积或异位表达。与正常对照者相比，先证者肌组织中人源（human，h）-DNAJB6bmRNA表达水平无明显差异，总h-DNAJB6mRNA表达水平明显降低。同时，先证者肌组织中野生型（widetype，wt）h-DNAJB6a蛋白表达缺失；总h-DNAJB6（wth-DNAJB6a+muth-DNAJB6a+h-DNAJBb）表达水平约为正常水平的1/8；Desmin和TDP-43表达水平明显升高，约为正常水平的两倍。依据ACMG指南，根据人群频率、家系共分离信息，致病性评价数据库的预测结果和上述实证结果，判定DNAJB6c.695_699del（p.Val232Glyfs*7）纯合突变存在PS4、PM2、PM4和PP1级别证据。 结论：在MFM的患者中首次发现DNAJB6的一个新纯合突变DNAJB6 c.695_699del（p.Val232Glyfs*7）。依据ACMG指南，我们推测该新突变是MFMs的可能致病变异。 第二部分：DNAJB6新纯合突变对小鼠运动功能及骨骼肌病理表型的影响 方法：利用CRISPR/Cas9基因策略构建与先证者突变同源的鼠源（mouse，m-）DNAJB6c.698_702del（p.V233Gfs*80）敲入（knockin，KI）小鼠，验证该突变对小鼠骨骼肌m-DNAJB6amRNA和蛋白表达水平的影响是否与临床患者一致。并连续观察KI小鼠3、6、9、12、18月龄多项运动行为学指标、骨骼肌组织病理和分子病理改变。 结果：与同窝野生型小鼠相比，12月龄纯合型小鼠骨骼肌m-DNAJB6a的mRNA（P=0.0023）及蛋白（P=0.0018）表达水平显著降低；与同窝野生型小鼠相比，9月龄纯合型小鼠双上肢悬挂时间（P=0.023）、转棒时间（P=0.034）及跑台时间（P=0.022）显著降低，12月龄纯合型小鼠四肢抓力持续显著降低（P=0.0023）；与同窝野生型小鼠相比，12月龄纯合型小鼠肌细胞琥珀酸脱氢酶及环氧化酶活性部分降低，IIA型肌纤维分布比例显著降低（P=0.025），IIB型肌纤维分布比例显著增高（P=0.012），18月龄纯合型小鼠肌细胞质中出现大量镶边空泡，DNAJB6和Desmin蛋白在胞膜下及胞质中异常聚集，空泡周围TDP-43、LC3B和p62蛋白表达量显著增高（P=0.002、0.004和0.001）。 结论：m-DNAJB6c.698_702del（h-DNAJB6c.695_699del的同源突变）纯合突变仅降低小鼠骨骼肌内m-DNAJB6a亚型的表达，并可致小鼠运动行为功能下降及类似人类MFMs的组织病理、分子病理表型。 第三部分：DNAJB6新纯合突变对polyQ蛋白抗聚集能力的影响及机制初探 方法：利用质粒构建及细胞转染的方法，比较野生型（WT）和突变型（mut）h-DNAJB6a质粒在HEK293T细胞中的表达水平及位置改变；通过mRNA和蛋白稳定性实验，探索h-DNAJB6c.695_699del纯合突变影响DNAJB6a表达水平的作用机制；另外，通过构建h-DNAJB6a对多聚谷氨酰胺（polyglutamine，polyQ）蛋白的抗聚集细胞模型，比较WT和muth-DNAJB6a对polyQ的抗聚集能力，并探索不同剂量muth-DNAJB6a与抗聚集能力的量效关系。 结果：细胞免疫荧光结果显示，WTh-DNAJB6a仅分布于细胞核中，而muth-DNAJB6a则分散在整个细胞中；与WTh-DNAJB6a相比，同等拷贝量的muth-DNAJB6a在HEK293T细胞中表达水平显著下降（P=0.0012），且其mRNA稳定性显著下降（P=0.0078）；然而，同等表达水平的WTh-DNAJB6a和muth-DNAJB6a对polyQ蛋白抗聚集能力的影响无显著差异（P=0.12），其抗聚集能力随muth-DNAJB6a表达水平的降低而逐渐降低。 结论：h-DNAJB6c.695_699del通过降低h-DNAJB6amRNA的稳定性而影响蛋白表达水平，并因此降低了其对polyQ蛋白的抗聚集功能。 全文结论：h-DNAJB6新纯合突变c.695_699del可导致肌原纤维性肌病的发生，可能的机制是通过降低DNAJB6a蛋白表达水平而致细胞内异常蛋白沉积。 本研究的创新之处： 1.首次在肌原纤维性肌病患者中发现DNAJB6的新突变位点，此位点在相关数据库中未见报道。 2.前期报道该基因突变的遗传模式均为常染色体显性遗传，而在本例患者的遗传模式为常染色体隐性遗传，很可能是因该基因突变致骨骼肌疾病的新遗传模式。 3.既往研究提示携带致病突变的DNAJB6b是MFMs发生的责任蛋白，而本研究发现的新突变仅影响DNAJB6a的表达，并导致临床肌病表型。因此，我们推测DNAJB6a对于骨骼肌结构和功能的维持亦具有重要作用，其功能缺失是导致MFMs发生的可能机制。 4.既往对于DNAJB6a蛋白C端氨基酸序列的功能未知，本研究发现C端缺失可显著降低DNAJB6amRNA稳定性，并导致蛋白表达量下降，是DNAJB6a亚型分子结构功能的新认识。
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