摘要
外科手术和外伤导致的不受控制的出血通常会造成非常严重的后果，防止大出血的发生对于促进手术成功和病人恢复至关重要，止血（或出血控制）成为临床医生、外科医生和手术护理者关注的重点。胶原蛋白有着非常优秀的止血性质，且在止血材料中应用广泛。但是，现阶段胶原蛋白的主要来源为牛或猪，这种类型的胶原蛋白可能会成为动物体病毒的载体，传播诸如疯牛病或口蹄疫。此外猪来源的胶原蛋白还会造成宗教问题。所以需要开发一种新型来源的胶原蛋白来解决这些问题。海蜇是海洋中的一种浮游动物，因其资源丰富，且体内胶原蛋白含量较多，所以海蜇可以成为新型胶原蛋白的一种潜在来源。在此之前，有人对海蜇胶原蛋白的提取进行了初步研究，其应用大多在食品科学领域，而对其生物活性特别是在止血领域应用的研究未见有报道。本文对海蜇胶原蛋白进行了提取，并研究了由其构成的不同止血材料的止血性及促愈合性质，证明海蜇胶原蛋白在止血上应用的可行性。 本文使用酸溶法和酶溶法对海蜇胶原蛋白进行了提取，分别获取了酸溶性胶原蛋白（ASC)和酶溶性胶原蛋白（PSC)。通过对提取条件进行优化获得了海蜇胶原蛋白最佳的提取条件：ASC为醋酸浓度0.5M下处理72h，PSC为醋酸浓度0.5M下处理48h后使用0.1%胃蛋白酶处理24h。最佳条件下ASC和PSC的提取率分别为0.12%和0.28%。通过SDS-PAGE凝胶电泳、红外光谱分析以及氨基酸组成分析对海蜇胶原蛋白进行分析可得海蜇胶原蛋白类似于脊椎动物I型胶原蛋白，但在结构上略有不同。透射电镜（TEM)结果表明，海蜇胶原蛋白溶液中胶原蛋白纤维不会规则排列形成明暗相间的周期性横纹结构。 通过冻干法制备了胶原蛋白海绵，并使用EDC/NHS对海绵进行了不同程度的交联。红外光谱检测表明了交联过程对胶原蛋白的分子结构没有太大的影响。扫描电镜（SEM)分析可知海蜇胶原蛋白止血海绵表面及内部呈现一种内部相互连接的网状结构，具有较大的孔隙率。海绵内部的孔隙保证了胶原蛋白海绵具有优良的吸水性质，吸水性实验显不了不同海绵吸水性为20%?40%，amp;nbsp;明显大于医用纱布的吸水性（2.67%)。体外降解性实验中未交联海绵的降解率在13%左右，而交联后海绵降解率降低到4%?5%，表明交联过程明显地提升了海绵的机械性能。体外凝血实验中，海蜇胶原蛋白止血海绵的凝血指数（BCI)低于0.5，而医用纱布的BCI指数为0.7，说明海蜇胶原蛋白止血海绵具有较好的止血活性，对止血后的海绵进行SEM检测发现海绵的促凝血机制主要为促进血液中红细胞及血小板的附着与聚集，增加海绵附近血细胞浓度，从而加快血液凝结。大鼠断尾实验中，海蜇胶原蛋白止血海棉处理后可以将伤口的止血时间从（3.11±0.39)min降低到（1.00±0.30)min，伤口出血量从（21.67土3.51)g降低到（5.33±0.58)g，表明胶原蛋白海绵具有优良的止血性。 将硫酸软骨素（CS)与海蜇胶原蛋白海绵进行交联制备出海蜇胶原蛋白伤口敷料，发现该伤口敷料也具有了与之血海绵相似的网状结构，但孔隙率更小，且在网状结构中可以发现硫酸软骨素与胶原蛋白分子之间有良好的相互作用。红外光谱分析表明硫酸软骨素与海蜇胶原蛋白有很好的相容性。吸水性和体外降解性实验表明加入硫酸软骨素后，胶原蛋白伤口敷料的吸水性从(7.68±0.61)%下降到（6.45±0.66)%，降解率从(14.40±5.48)%提高到(32.87±4.97)%。对小鼠成纤维细胞（L-929)的培养表明胶原蛋白伤口敷料能明显促进细胞的生长。大鼠愈伤实验表明，海蜇胶原蛋白伤口敷料有优秀的促愈性质，且加入硫酸软骨素后可以加快伤口愈合的速度。 使用微包囊发生器制备胶原蛋白微球，原理为共轴气流法，其中能影响微球制备的条件主要为气压强度和液流流速。通过改变制备条件，发现当气压强度为30mbar，液流流速为8ml/h时，可以产生球形良好，粒径较小的微球，制备的海藻酸妈微球平均粒径约为160pm。光镜和扫描电镜检测可以证明共轴气流法制备胶原蛋白微球是可行的，且制备出的微球球形良好。通过对微球的红外光谱进行检测可得制备微球的过程中胶原蛋白的结构和性质没有发生变化。改变海藻酸钠/胶原蛋白混合溶液中两种成分的比例制备微球后发现，胶原蛋白对于微球粒径影响较大，其中海藻酸钙微球粒径为（157.35±25.62)pm，混合微球粒径大小范围为230?290畔，胶原蛋白微球粒径为（487.67±89.02)pm。吸水性方面，胶原蛋白微球的吸水率为（50.37±7.88)%，明显要比海藻酸钙微球（10.25±4.37)%要高，而胶原蛋白-海藻酸钙微球中胶原蛋白含量的增高及海藻酸钙含量的减少都能使微球的吸水性提高。微球的溶胀性与吸水性相似，胶原蛋白微球溶胀性最高为（8.36±1.89)%，海藻酸钙微球溶胀性最低(1.50土0.34)%。体外降解性实验中，胶原蛋白微球的降解率为（16.23土2.56)%，而含有海藻酸钙的微球的降解率都在10%以下，表明了微球良好的机械性质。细胞毒性实验表明大鼠正常肝细胞（BRL-3A)在胶原蛋白微球和胶原蛋白-海藻酸钙微球上生长状况良好，培养7天后细胞活性分别为空白对照组的(115.45±9.14)%和(112.84±4.11)%。 胶原蛋白止血微球体外凝血实验表明胶原蛋白微球和胶原蛋白-海藻酸钙微球有良好的促凝性质，而在大鼠股静脉伤口模型和肝损伤模型中，胶原蛋白微球可以将止血时间分别从（2.50±0.50)min和（2.06±0.43)min缩短为（0.83±0.29)min和（0.56±0.24)min,表明胶原蛋白微球良好的止血性质。组织学染色分析表明了胶原蛋白蛋白微球有良好的体内降解性以及组织相容性，并有促进肝脏损伤的愈合的效果。 本文对海蜇中胶层内的胶原蛋白进行了提取，并对其理化性质和生物学性质进行了系统的研究。通过冻干法制备了海蜇胶原蛋白止血海绵和伤口敷料，表明了其良好的表皮止血和促愈合性质。使用微包囊发生器制备出胶原蛋白止血微球，并证明了它们在深层出血及实质性器官出血的止血方面展现了良好的功能。这两种止血材料有望在未来成为新型的止血剂。
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