摘要
海洋约占地球表面积的70%，平均水深3800米，深海除了“荒漠”般的平原外，还含有多种不同的海底环境，如热液、冷泉、深海珊瑚、泥火山、海山和海沟等。深海热液喷口和热液生态系统是20世纪生命学界最重要的发现之一，硫氧化细菌作为热液生态系统的缔造者和维护者，主要通过化能合成作用为整个生态系统提供初级生产力。冲绳海槽热液区位于东亚大陆架边缘，是距我国最近的热液区。本研究对冲绳海槽南部热液区与非热液区及其他海域（包括南极和马里亚纳海沟）沉积物中的可培养硫氧化细菌进行了多样性研究，并对7株细菌的硫氧化活性进行了检测；对分离得到的两株硫氧化细菌进行了全基因组测序，分析了其可能的硫氧化机制。除此之外，本文还对东太平洋结核区结核样品的可培养细菌进行了多样性研究，并对分离得到的菌株进行了锰氧化，密度感应（quorumsensing,QS），密度感应猝灭（quorumquenching,QQ），脂酶（吐温20、吐温40和吐温80），琼胶酶等11种酶学性质的检测。 采用SOB、SPG和ASC三种选择性培养基对冲绳海槽热液区和非热液区沉积物样品的硫氧化细菌进行了分离鉴定和保藏，两种样品共保藏细菌399株，其中热液区保藏313株，非热液区保藏86株。根据实验培养过程中培养基的颜色变化，本实验共分离得到172株硫氧化细菌，其中热液区为143株，非热液区为29株。 根据PCR产物酶切图谱的差异，对冲绳海槽热液区的85株硫氧化细菌进行了16SrRNA基因测序，产酸硫氧化菌和产碱硫氧化菌分别为69株和16株，占测序总数的81.2%和18.8%。产酸硫氧化菌与产碱硫氧化菌的不同之处在于其除了在γ-变形菌纲，α-变形菌纲和厚壁菌门中有分布外，还分离获得了放线菌门的细菌。在产酸硫氧化菌中，α-和γ-变形菌纲的细菌均占产酸硫氧化菌总数的44.93%，而γ-变形菌纲细菌是产碱硫氧化菌的优势类群，占产碱硫氧化菌总数的81.25%。根据酶切图谱的差异，对冲绳海槽非热液区的12株硫氧化细菌进行16SrRNA基因测序，产酸硫氧化菌和产碱硫氧化菌的数目分别为9株和3株。产酸硫氧化菌由变形菌门（Proteobacteria）及厚壁菌门（Firmicutes）组成，产碱硫氧化菌均由变形菌门组成。此外，其他非热液区还分离得到12株硫氧化细菌。对7株细菌进行了硫代硫酸钠氧化能力实验，产酸硫氧化菌株的pH值下降1.63-4.08个pH单位；产碱硫氧化菌株的pH值升高0.56-1.2个单位。硫代硫酸钠的氧化程度在31%-100%之间。 选取分离自冲绳海槽热液区的两株硫氧化细菌进行了全基因组测序，其中一株为产酸硫氧化细菌（海洋柠檬胞菌SOB39），一株为产碱硫氧化细菌（泰坦尼克号盐单胞菌SOB56）。采用Canu软件对获得的测序数据进行了全基因组的混合组装，海洋柠檬胞菌SOB39拼接结果为10个contigs，泰坦尼克号盐单胞菌SOB56的拼接结果为1个完成图。两株硫氧化细菌基因组的大小分别为6.0Mb和5.2Mb，基因组DNAG+C含量分别为66.3mol%和54.6mol%。通过对基因组序列进行分析，发现海洋柠檬胞菌SOB39基因组中包含有sox基因簇，其硫代硫酸钠氧化代谢采用PSO代谢途径。通过构建系统进化树分析了海洋柠檬胞菌中的硫氧化基因soxB相对保守。采用本地Blast的方法对泰坦尼克号盐单胞菌SOB56基因组中的硫代谢相关基因进行比对，发现其中一个基因与已报道的硫氧化基因L0AAK3的覆盖度为84%，相似度为30.3%，因此此基因可能在泰坦尼克号盐单胞菌SOB56中负责编码硫代硫酸盐脱氢酶，氧化硫代硫酸钠产生连四硫酸盐。 对东太平洋结核区结核样品的可培养细菌进行多样性分析，共分离保藏396株，对98株菌进行16SrRNA基因测序，这些菌株分属于4个门，18个属和37个种。四个门分别为变形菌门，共92株，占93.9%；厚壁菌门，共4株，占4.08%；放线菌门，共1株，占1.02%；拟杆菌门，共1株，占1.02%。优势属为假单胞菌属（Pseudomonas）、盐单胞菌属（Halomonas）、副球菌属（Paracoccus）、亚硫酸盐杆菌属（Sulfitobacter）等，优势种为产类胡萝卜素副球菌（Paracoccuscarotinifaciens）、庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌（Sulfitobacterpontiacus）、海滨橙色单胞菌（Aurantimonaslitoralis）等。对结核样品的98株细菌进行11种酶学性质的检测，含有过氧化氢酶活性的菌株所占的比例最高，为96.94%；较高比例的细菌具有酯酶（吐温20和吐温40）活性，分别占总数的40.82%和18.37%；而具有酯酶（吐温80）和β-半乳糖苷酶活性的细菌所占的比例最少，分别占总数的10.20%和7.14%。另外实验发现13株细菌具有锰氧化活性，分别为庞蒂亚克亚硫酸盐杆菌（Sulfitobacterpontiacus）、南极中山菌（ZhongshaniaAntarctica）、嗜碱盐单胞菌（Halomonasalkaliantarctica）、海滨橙色单胞菌（Aurantimonaslitoralis）、黑沙假单胞菌（Pseudomonassabulinigri）、产黑假交替单胞菌（Pseudoalteromonasnigrifaciens）和盐屋埼假交替单胞菌（Pseudoalteromonashaloplanktis）。 综上所述，本论文首次对冲绳海槽热液区可培养硫氧化菌的群落结构进行了分析，发现该地区的硫微螺菌属（Thiomicrospira）、拉布伦茨氏菌属（Labrenzia）和海旋菌属（Thalassospira）为可培养硫氧化菌的优势类群；对分离得到的两株硫氧化细菌进行了全基因组测序，首次得到了泰坦尼克号盐单胞菌SOB56的基因组完成图，以及海洋柠檬胞菌SOB39的基因组精细图，并对两株不同氧化类型硫氧化细菌的硫氧化机制进行了初步的分析；对东太平洋结核区结核样品中可培养细菌的群落结构进行了研究，并对98株细菌进行了11种酶学性质的检测，获得了大量含有多种酶活的菌株，能够为洗涤业、食品业和水产养殖业等多种不同行业提供菌种资源，为后续开发奠定了基础。
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