摘要
目的：制备活性Ⅱ型胶原，探讨胶原诱导（Collagen induced arthritis，CIA）和佐剂诱导性（Adjuvant induced arthritis，AIA）类风湿关节炎发病机制，对独羌药对活性成分群抗类风湿关节炎作用研究。 方法：1.建立Woessner法测定Ⅱ型胶原中羟脯氨酸含量；以鸡胸软骨为提取原料，采用有机酸溶胀结合胃蛋白酶提取活性Ⅱ型胶原，通过单因素试验和响应面试验相结合优化酶提工艺；对精制Ⅱ型胶原进行结构表征。2.复制CIA和AIA大鼠模型，从相关病理和生化指标、代谢组学、肠道菌群探讨两种模型发病机制。3.通过构建活性成分群-核心靶点网络、PPI网络寻找关键靶标，并核心靶点进行GO和KEGG功能分析，最后利用分子对接技术对MAPK信号通路进行验证；复制CIA大鼠模型，通过相关病理及生化指标的检测，考察独羌药对及活性成分群（补骨脂素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手酚、佛手酚内脂、花椒毒素、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、紫花前胡苷）体内抗RA药理活性作用；采用UPLC QTOF/MS结合多元统计分析CIA大鼠经独羌药对及其活性成分群干预后血清、粪便和尿液的非靶向代谢组学分析；采用16S rRNA基因测序技术对独羌药对及活性成分群治疗前后CIA大鼠的粪便菌群结构进行分析。 结果：1.Woessner法测定Ⅱ型胶原含量快速稳定，胶原水解为羟脯氨酸条件为HCl浓度10mol/L、料液比1∶1、温度110℃、水解6h、调pH至6。提取活性Ⅱ型胶原的最优条件为酶浓度6%、酶提时间40h、料液比1∶20，计算Ⅱ型胶原得率为0.81%。精制Ⅱ型胶原表面结构呈白色、疏松的纤维状、无异味，SDS-PAGE测得分子量为135KDa，甘氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸分别占总氨基酸的24.52%、10.29%、0.35%、1.50%和1.03%，紫外光谱分析220nm处有最大吸收峰，圆二色谱及红外表明Ⅱ型胶原具有二级结构，电镜扫描Ⅱ型胶原在提取过程保持原有的纤维结构，Ⅱ型胶原在pH7.5、氯化钠浓度40g/L溶解度最低。2.CIA大鼠发病是从耳缘及尾部结节开始，后肢双侧踝关节肿胀蔓延至双前足肿胀，最后踝关节僵直。AIA模型注射在右后足跖处注射CFA6h后开始肿胀，3d后到达高峰，此为该模型的原发病变，从16d开始出现全身免疫症状。CIA和AIA大鼠模型均能刺激胸腺和脾脏两种免疫器官增殖，其中AIA模型对于胸腺的增殖更为明显。HE染色和Micro-CT扫描结果可知CIA大鼠踝关节炎症细胞浸润、软骨及骨的破坏相较于AIA来说较为严重。CIA大鼠和AIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10与Con组相比均有显著性差异含量（P＜0.001），但两种模型无显著性差异（P＞0.05）。CIA大鼠血液中有29种、粪便中37种和尿液中23种代谢物紊乱，AIA大鼠模型血液17种、粪便19种和尿液中21种差异代谢物。两种模型血液、粪便中的差异化合物有部分重合，但尿液中有18种差异化合物相同。这些代谢物主要参与氨基酸代谢和脂质代谢。在门水平，优势菌门厚壁菌门和拟杆菌门丰度发生改变，在CIA模型中两种菌门均有显著差异，在AIA模型中虽然也发生了改变，但没有显著性差异。在属水平上，CIA大鼠模型中厚壁菌门的Blautia、unclassified_f_Lachnospiracea、Eubacterium_siraeum_group菌属丰度显著性降低（P＜0.05），拟杆菌门的Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae_UCG-001和厚壁菌属的Phascolarctobacterium丰度显著增加（P＜0.05）。在AIA模型中，厚壁菌属的Fusicatenibacter、UCG-008、Subdoligranulum丰度显著降低（P＜0.05），拟杆菌门的Prevotellaceae_UCG-001丰度显著增加（P＜0.05）。3.构建活性成分群与核心靶点网络，142个节点和472条边，AKR1B1、EGFR、PDE4D、AR、AKR1C3、ALOX5等在该网络中度值排名较高。PPI网络中，ALB、TNF、EGFR、MAPK1、PTGS2、MAPK8在蛋白互作网络具有重要作用。核心靶点生物过程共富集得到1867条，分子生物功能132条，细胞过程51条，KEGG共富集到123条通路。分子对接结果表明活性成分群与MAPK信号通路蛋白均具有较高的亲和力。独羌药对及活性成分群经灌胃治疗CIA大鼠模型后，大鼠体重增加、组织肿胀度降低、宏观评分降低。HE染色和Micro-CT结果表明独羌药对及成分群高剂量组对炎症、骨破坏方面效果较好。RT-PCR法、蛋白质印迹法表明活性成分群高剂量可抑制P38、ERK、JNK磷酸化的水平。独羌药对及活性成分群能通过调节氨基酸代谢紊乱代谢（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成及降解，苯丙氨酸代谢，赖氨酸代谢，色氨酸代谢），α-亚麻酸代谢，谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢及肉碱代谢发挥治疗RA。Prevotellaceae_NK3B31_group在MOD组中丰富显著增高（P＜0.01），经独羌药对和活性成分群给药后，Prevotellaceae_NK3B31_group丰度回调并有显著性差异（P＜0.01）。 结论：本次研究精制的Ⅱ型胶原具有较好的活性，CIA大鼠模型与AIA大鼠模型相比，CIA模型与类风湿关节炎患者发病机制更为相似。独羌药对活性成分群可能是药对发挥抗类风湿关节炎的等效成分组合。通过改善CIA大鼠氨基酸、脂质等代谢途径以及调节肠道微生物菌群结构改变。
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