摘要
青杄(Piceawilsonii)属松科云杉属植物，为我国特有的常绿针叶绿化树种，也是重要的园林绿化和用材林树种，耐寒性较强，耐旱性较弱，其如何响应非生物胁迫的分子机制尚不明确。本实验室从青杄的cDNA文库中分离得到两个NF-Y类转录因子，并命名为PwNF-YB8/13。实验室前期已经初步对于PwNF-YB8、PwNF-YB13的基因特性进行了研究，表明这两个基因可能在青杄响应干旱、盐等逆境胁迫过程中发挥作用。本研究在实验室前期的研究基础上，对青杄中的PwNF-YB8和PwNF-YB13进行进一步的功能研究和表型分析。通过酵母单杂交、亚细胞定位及转基因等试验对目的基因的功能进行了深入探索和验证。利用农杆菌介导的花序浸染方法，获得异源过表达PwNF-YB8/13的拟南芥植株，且通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，分别获得拟南芥的突变体植株nfyb8-cas9#1(C8-F9)、nfyb8-cas9#12(C8-F12)、nfyb13-cas9#7(C13-L7)，探究转基因株系植株在干旱、盐胁迫下的表型差异。主要研究结果如下： 1.转录激活活性分析发现，在SD/-Trp-His-Ade三缺培养基上，只有阳性对照(即转化pBD-NAC092的酵母)才能生长，而转化空pBD、pBD-PwNF-YB8-N和pBD-PwNF-YB8-C及pBD-PwNF-YB8等的酵母均不能正常生长，显示PwNF-YB8的N端结构域、C端及其全长均不具有转录激活活性。 2.通过注射农杆菌瞬时表达烟草叶片的方法进行亚细胞定位试验，结果显示，无论GFP标签在N端或在C端，PwNF-YB8和PwNF-YB13都主要定位在细胞核和细胞质中。 3.利用双分子荧光互补试验，在黄色荧光场中，只有转入35S::pSPYNE:PwNF-YB8+35S::pSPYCE:PwHAP5的农杆菌的实验组发出黄色荧光信号，这进一步证明了PwNF-YB8与PwHAP5的互作。 4.利用CRISPR/Cas9技术获得拟南芥突变体植株，并在DNA水平进行检测。突变PwNF-YB8/13在拟南芥中的同源基因AtNF-YB8/13，获得突变体nfyb8-cas9#1(C8-F9)、nfyb8-cas9#12(C8-F12)、nfyb13-cas9#7(C13-L7)。 5.农杆菌转化法异源转化拟南芥，获得异源过表达和同源过表达植株。RT-qPCR试验，测定目的基因在转基因植株中的表达量。P8-L4中PwNF-YB8的基因表达量上升至47倍，P8-L5中的表达量上升至35.53倍；P13-L4植株中基因PwNF-YB13的表达量上升至26.2倍，P8-L5的表达量上升至30.1倍。A8-L1植株中基因AtNF-YB8的表达量上升至14.7倍，A8-L3的表达量上升至34.9倍；A13-L1植株中基因AtNF-YB13的表达量上升至21.3倍，A13-L5的表达量上升至1107.3倍。 6.异源过表达PwNF-YB8/13到拟南芥中，观察野生型、转空载体植株、突变体植株以及异源转基因拟南芥幼苗在干旱、盐胁迫下的表型，测定不同植株相应萌发率及根长，观察表型差异。结果显示nfyb8-cas9#1、nfyb8-cas9#12在100、200、300mM甘露醇处理下萌发率为17.0%、14.3%、6%、5.0%、2.0%、2.3%，显著低于其他株系萌发率；在150mMNaCl处理下，萌发率分别为46.0%、72.7%，也显著弱于其他株系，突变体植株在逆境胁迫中表现出更高的敏感性。异源过表达PwNF-YB8植株萌发率相较于野生型植株差异不显著，但在50、100、150mMNaCl及100、200、300mM甘露醇处理下根长显著长于对照组和突变体株系，显示出了一定程度的耐受性；异源过表达PwNF-YB13植株在干旱和盐胁迫下的萌发率及根长与对照组差异不显著，但成苗状态下显示出株高优势及提前成熟迹象，其可能参与干旱逆境下的开花表型调控。
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