摘要
目的：左金丸是明朝朱丹溪记载的古代经典名方之一，该方是由黄连和吴茱萸固定比例（6:1）配伍组成，具有调节胃肠道动力，减少胃酸分泌、抗炎、抑制溃疡等药效，现代临床常用于胃肠道炎症、溃疡性胃肠病和反流性食管炎等疾病。近年来，随着中药左金丸药理研究逐渐深入，左金丸在临床上的使用范围也逐步得到扩大，除炎症性消化系统疾病外，左金丸在抗溃疡、抑制肿瘤生长以及调节胃肠功能等方面均具有重要作用。随着对左金丸安全性评价和监管的深入，国内外相继报道出关于黄连致新生儿溶血性黄疸、腹泻及神经毒性等临床不良反应发生，而左金丸中黄连比例较高，其安全性问题同样引起了国内外学者的高度关注。目前，左金丸主要毒性成分集中在生物碱，尤其是黄连所富含的异喹啉类生物碱。本课题采用组分潜在毒性解析方法，通过细胞模型和动物模型，系统筛选了左金丸组成成分的潜在毒性，从物质基础结合网络靶点筛选策略出发，从“细胞毒性发现关键事件-动物毒性评价终点事件-代谢组学靶点通路分析”三个层次综合解析左金丸中黄连碱的潜在肝毒性机制。课题以左金丸的有效组分-黄连碱为研究对象，深入研究黄连碱的细胞毒性及靶器官毒性，为正确认识并科学使用含黄连碱类中药或复方提供毒理学实验数据。 方法：(1)采用不同剂量的黄连水提液、吴茱萸水提液处理L02细胞，CCK-8法检测细胞存活率从而筛选左金丸中主要的肝毒性成分。（2）通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察不同浓度黄连碱对L02细胞凋亡和线粒体膜电位的影响，同时检测细胞内活性氧及钙离子含量的改变。（3）通过Western-blot技术检测黄连碱是否能干预肝细胞凋亡及内质网应激相关蛋白的表达。（4）采用传统的中药肝毒性评价手段（急性毒性实验和亚急性毒性试验），从动物水平上检测黄连碱对小鼠肝损伤等生理生化指标的影响，包括小鼠体重、脏器系数、血清生化、组织病理学检测等。（5）通过非靶向代谢组学方法识别小鼠血浆内源性代谢产物，结合多元统计法筛选组间差异代谢物，并进行代谢通路分析来进一步探讨黄连碱致肝脏毒性的机制。 结果：(1)黄连水提物、吴茱萸水提物及左金丸有效组分黄连碱对L02细胞均显示出明显的细胞毒性，其中黄连和吴茱萸水提物IC50分别为0.7872mg/ml和6.38mg/ml，黄连碱IC50为26.81μmol/L；（2）黄连碱以低（12.5μmol/L）、中（25μmol/L）、高（50μmol/L）浓度共同作用于细胞时，可显著诱导L02细胞发生凋亡且成剂量相关性，具体表现为线粒体膜电位明显下降，细胞内大量ROS蓄积，细胞内钙离子稳态失衡；（3）Western-blot检测结果显示：黄连碱可剂量依赖性诱导细胞凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、细胞色素c和内质网应激相关蛋白CHOP、ATF4、caspase-12的表达；（4）整体动物水平研究结果：急性毒性实验提示黄连碱不具有明显的急性毒性；亚急毒性实验提示黄连碱对ICR小鼠进行连续28天灌胃处理后，小鼠肝组织病理检测出现不同程度的肝细胞水肿，偶见散在炎症细胞灶，初步判断长期服用黄连碱可造成小鼠肝损伤；且损伤程度与服用剂量相关；（5）代谢组学研究结果显示：黄连碱对肝脏的毒理作用机制与氨基酸代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、血小板活化等途径密切相关。 结论：对左金丸有效组分进行肝细胞毒性筛选，首次发现黄连水提液肝细胞毒性大于吴茱萸水提液；对其主要成分进行肝细胞毒性筛选时发现黄连碱的肝细胞毒性最大。为进一步研究并探索黄连碱肝细胞毒性具体作用机制，本研究依次从细胞凋亡、活性氧、线粒膜电位（经由流式细胞术检测）、细胞内钙离子（经由激光共聚焦显微镜检测）、western-blot技术结合非靶向代谢组学等方面，结合体内外实验方法对多项药源性肝毒性特征指标进行考察。结果表明：黄连碱肝细胞毒性的主要表现为其在低剂量条件下线粒体膜电位发生明显改变，高剂量条件下激活内质网应急PERK通路；二者均参与细胞内活性氧蓄积；进一步导致细胞内钙离子紊乱；最终诱导细胞走向凋亡。为探究黄连碱在体内动物模型上的肝损伤作用，通过急性毒性实验和亚急性毒性实验发现连续4周服用黄连碱可造成ICR小鼠肝损伤。为探索黄连碱对机体内源性代谢物的影响及其肝脏毒性的机制，采用非靶向代谢组学对小鼠血浆代谢物进行识别和分析，发现黄连碱可显著影响氨基酸代谢及脂肪酸代谢。黄连碱肝脏毒性是否与其参与上述两个代谢过程有关有待进一步深入研究。我们认为氨基酸和脂质代谢紊乱可能是间接造成黄连碱体内肝脏毒性的重要因素，即黄连碱可能通过脂质代谢紊乱导致细胞发生氧化应激，进一步导致线粒体损伤及内质网应激PERK通路被激活，介导细胞凋亡并最终导致机体体内肝脏损伤的发生；提示长期使用含黄连碱类中药制剂可能具有潜在的肝毒性风险。
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