摘要
大豆疫霉根腐病的致病菌为大豆疫霉菌，是大豆生产上的毁灭性病害之一，造成的经济损失日趋上升。防治该病害最经济有效的途径是合理利用抗、耐病品种，但是由于大豆疫霉菌变异速度快，仅仅进行抗源筛选是不能够满足生产上的需求。因此，需要对大豆与大豆疫霉菌互作的分子机制进行深入分析，从而在根本上防治该病害。植物激素在调节植物抵抗病原菌侵害时作为天然的信号分子起作用。茉莉酸激素通过调节防御响应基因的表达参与到植物与病原菌的互作中，是公认的植物防御激素。JAZ蛋白是茉莉酸信号中重要的负调控因子，实验室前期通过RNA-seq在疫霉菌感染后的GmWRKY40-RNAi转基因毛状根中鉴定到JAZ基因上调表达，说明JAZ基因很有可能参与到大豆与大豆疫霉菌的互作中。本研究通过对大豆JAZ基因进行生物信息学分析以及功能分析，初步探索了大豆JAZ基因在大豆抗大豆疫霉菌免疫过程中的功能。主要研究结果如下: 1.大豆JAZ基因家族的鉴定与疫霉菌诱导表达 利用生物信息学分析方法在大豆基因组中发现了24个JAZ基因，它们不均匀的分布在大豆的14条染色体上，其中9号染色体上分布的数目最多，为4个。进化分析显示，大豆、拟南芥和水稻的JAZ基因家族可分成5个亚组(C1～C5)，其中大豆与拟南芥的JAZ基因亲缘关系最近。同一亚组的成员在外显子和内含子的数量与长度上相似。该家族成员大多含有响应茉莉酸和脱落酸等激素的顺式作用元件，少数含有响应逆境胁迫的顺式作用元件。大豆疫霉菌处理后，C4亚组成员显著上调表达，C1亚组成员微弱上调，而C2、C3和C5亚组成员下调表达，表明大豆JAZ基因家族成员对大豆疫霉菌的胁迫具有不同的响应模式。 2.大豆GmJAZ17在大豆抗疫霉根腐病中的功能分析 通过实时荧光定量在大豆根、茎、叶、子叶四个组织中均检测到了GmJAZ17的表达，在根中表达量最高，叶次之，在茎与子叶中最低。激素处理后，GmJAZ17受到MeJA诱导表达，在处理后3h该基因的表达水平达到峰值，随后逐渐下降。通过构建表达载体pBIN-GmJAZ17-GFP4，使基因与GFP荧光蛋白融合表达。利用农杆菌介导的瞬时表达体系，将融合载体注射进烟草细胞中，观察GmJAZ17的定位情况。结果显示GmJAZ17蛋白定位于细胞核。 在大豆Williams(rps)品种中过表达GmJAZ17基因，获得转基因发状根。过表达转基因发状根与空载体发状根接种疫霉菌块后，过表达转基因发状根病斑长度比空载体更长，发病情况更加严重。接种疫霉游动孢子后，过表达转基因发状根中的疫霉积累量高于空载体，防御相关基因GmPR1a和GmPR5在过表达转基因发状根中的上调程度显著弱于空载体，茉莉酸信号中的防御标志基因GmPDF1.2的表达情况也类似，GmPDF1.2的表达在过表达发状根中受到抑制。表明GmJAZ17可能是通过调节JA信号的转导从而负调控大豆对大豆疫霉菌的抗性。 通过酵母双杂交，鉴定到GmJAZ17可与大豆JAZ蛋白发生相互作用形成同源或异源二聚体。此外，GmJAZ17可以与茉莉酸信号中的关键转录因子GmMYC2（与拟南芥MYC2高度同源）发生强烈互作。通过筛选大豆疫霉菌诱导的大豆酵母杂交cDNA文库，发现GmJAZ17可以与GmJAZ9、GmJAZ15、GmJAZ19等JAZ蛋白互作，此外还有一些防御相关蛋白，如GmOLPa、GmOPLb。通过BiFC实验进一步验证互作蛋白，将GmMYC2、GmJAZ19构建至cYEP载体，GmJAZ17构建至nYEP载体，利用农杆菌介导的瞬时表达体系将GmMYC2-cYEP，GmJAZ17-nYEP共注射烟草细胞，GmJAZ19-cYEP，GmJAZ17-nYEP同样共注射烟草细胞。激光共聚焦检测发现这两个实验组可以在烟草细胞中发生互作，均检测到了黄色荧光信号。
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