钙调控转玉米C4-PEPC基因水稻的耐旱性

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中文摘要：干旱胁迫制约着粮食作物尤其是水稻的生长和发育，降低作物产量。C4植物，如玉米，在干旱等逆境条件下表现较高的光合效率和水分利用率，具有一定的作物产量和抗逆性。因此，人们一直希望将C4植物中的关键基因转入C3植物水稻中，增强水稻光合效率和耐逆性。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC.1.1.31)是C4植物光合途径的关键酶，PEPC不仅提高C4光合效率中起到关键作用，在耐旱性方面也扮演着重要的角色。现已通过基因工程技术获得高表达转玉米PEPC基因水稻，表现出较强的光合能力和较高产量，而且在干旱胁迫下具有较高的净光合速率和抗氧化能力。但转PEPC水稻对干旱胁迫的响应机理目前研究较少。钙离子作为第二信使参与植物响应干旱胁迫反应。之前的工作已经发现，转玉米C4-PEPC基因水稻叶片含有较高浓度的钙离子，并且低浓度NO供体可通过细胞钙信号调控PC植株叶片PEPCase酶活性，表现较高的净光合速率。认为钙可能是在调控水稻耐旱响应上起到一定的作用。本研究以转玉米C4-PEPC基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)为材料，研究在PEG-6000(Polyethylene glycol-6000，PEG-6000)模拟的干旱胁迫下，钙离子对转基因水稻的耐旱作用。主要结果如下: 1、使用外源氯化钙溶液处理材料，研究15％PEG-6000胁迫处理2天和复水2天中水稻光合生理变化。结果表明，低浓度(0.5mmol·L-1)CaCl2缓解PC水稻叶片相对含水量的下降，10mmol·L-1钙离子处理作用不明显。不同浓度的钙处理对干旱胁迫下PC水稻的光合参数作用不明显。叶片内源钙含量的结果进一步显示，在PEG-6000处理下，PC具有稳定内源钙离子浓度的能力，但过高浓度钙离子(10mmol·L-1CaCl2)处理反而降低了PEPC酶活性、PEPC基因表达和可溶性蛋白的含量。结果提示内源钙在PC响应干旱胁迫中起到重要的作用。 2、为研究C4型PEPC基因水稻内源钙在调控耐旱性中的作用，以PC水稻和野生型水稻为材料，利用钙离子螯合剂和细胞内钙离子通道抑制剂，观察水稻对PEG-6000胁迫处理的响应能力，同时，测定叶片内源过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、脱落酸(ABA)含量，以及PEPC、钙调素(Calmodulin，CaM)，抗氧化酶活性，并测定干旱相关基因的表达。结果表明，PEG胁迫处理下，PC水稻和WT水稻表型上无差别，但是PC水稻表现出较高的光合效率和存活率。在响应干旱胁迫中PC水稻表现出降低超氧阴离子自由基产生速率，快速清除叶片超氧阴离子含量，这个过程依赖于内源钙。PEG胁迫处理提高PC水稻叶片H2O2和NO含量，而EGTA(Glycol-bis(b-aminoethylether)-N,N,N'',N''-tetraaxetic acid)和RR(Ruthenium red)处理降低其含量，但对ABA无影响。同时PEG胁迫处理提高PC水稻CaM含量、SOD和CAT活性。进一步发现，内源钙提高了抗旱相关转录因子NAC6、bZIP60基因、钙依赖的蛋白激酶CPK9(Ca2+-dependent protein kinase，CDPKs)基因以及C4-PEPC基因的表达，进一步提高PC水稻对干旱的适应能力。 3、为了研究蛋白磷酸化对PC水稻酶活性的影响，进一步分析了PC水稻和WT水稻叶片总蛋白激酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)在PEG-6000胁迫处理下的活性变化。结果表明，在15％PEG胁迫不同时间(150min)下，WT叶片中的总蛋白激酶活性并没有发生明显的变化，PC水稻叶片总蛋白激酶活性则表现出先增高后降低的趋势，在PEG处理30分钟时总蛋白激酶活性达到最大。PC水稻叶片PEPCK活性变化与总蛋白激酶活性基本一致，在60分钟活性达到最大。WT在PEG胁迫处理不同时间下PEPCK活性没有显著变化。使用RR处理抑制了PEG胁迫下PC水稻总蛋白激酶活性的增加，EGTA处理则完全将PEG诱导的总蛋白激酶活性降低至对照水平。同样，EGTA和RR预处理完全抑制PEG诱导的PC水稻PEPCK活性的提高。而EGTA和RR对WT总蛋白激酶和PEPCK活性影响不明显。使用H2O2清除剂DMTU和NO清除剂cPTIO研究PEG胁迫60分钟下叶片总蛋白激酶活性和PEPCK活性变化。结果发现，H2O2和NO信号分子参与PEG胁迫下PC水稻总蛋白激酶和PEPCK活性的增加。结果表明，干旱胁迫下，PC水稻通过内源钙诱导叶片总蛋白激酶和PEPCK酶活性，提高C4-PEPC活性，这些过程是需要NO和H2O2参与。综上所述，具有较高的钙离子PC水稻在外加高浓钙离子处理下反而不利于抵抗胁迫伤害。内源钙在调控PC水稻耐旱性和适应干旱胁迫环境起关键作用。内源钙离子通过耦合H2O2和NO信号分子，通过转录水平和磷酸化水平提高C4型PEPC活性，促进PC水稻对外界环境做出快速响应，从而能够抵御胁迫环境，最大限度维持正常代谢活性。

作者：

刘小龙

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关键词：

转基因水稻干旱胁迫磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶净光合速率抗氧化能力

授予学位：

硕士

学科专业：

植物学

导师：

李霞；蔡庆生

学位年度：

2015

学位授予单位：

南京农业大学

语种：

中文

中图分类号：