摘要
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)是在营养受限的条件下，作为碳和能量在细菌中积累的一类脂肪族聚酯。由于PHA具有与普通热塑性塑料相似的性能，并同时具有可降解性、生物压电性、生物适应性等优良性能引起广泛关注。然而，由微生物发酵生产的PHA，因为合成成本较高和合成聚合物的结构单一等问题导致其应用推广困难。因此，降低PHA的合成成本和新型PHA的开发成为目前的研究热点。 本研究模拟PHA微生物体内代谢途径，以(R)-2HB/(R)-3HB为底物，利用PelotomaculumthermopropionicumJCM10971由来的乙酰辅酶A合成酶ACSPt合成的乙酰辅酶A提供辅酶A供体，选择分别来自C.propionicumJCM1430的丙酰辅酶A转移酶PCTCp，C.propionicum的β-丙氨酰辅酶A转移酶ACTCp以及ThermusthermophilusJCM10941的丙酰CoA转移酶PCTTt作为PHA聚合前体(R)-2HBCoA/(R)-3HBCoA的合成酶，再分别利用来自Ralstoniaeutropha的Ⅰ类PHA合酶PhaCRe和Pseudomonassp.SG4502的Ⅱ类PHA合酶PhaC1Ps(STQK)作为聚合前体(R)-2HBCoA/(R)-3HBCoA的聚合酶，构建不同的体外合成体系，通过1H-NMR、GPC探究其在不同途径、不同温度下，合成产物的结构与性质变化。 为了实现自主设计的PHA合成体系构建，首先，利用体外基因重组过表达方法大量制备了合成途径中涉及的三类酶：提供CoA供体的ACSPt；催化2HB/3HB底物合成聚合前体2HBCoA/3HBCoA的三种酶：PCTCp、ACTCp和PCTTt；聚合2HBCoA/3HBCoA的两种酶PhaCRe和PhaC1Ps(STQK)。浓度分析结果表明，三类酶的浓度分别为：ACSPt浓度为8mg/mL；PCTCp/ACTCp/PCTTt浓度分别为15mg/mL，20mg/mL,12mg/mL；PhaCRe/PhaC1Ps(STQK)浓度分别为16mg/mL，6mg/mL。活性分析结果表明，ACSPt比活力为0.058U/mg；PCTCp/ACTCp/PCTTt对(R/S)-3HB底物的比活力分别为0.47U/mg，0.46U/mg，0.52U/mg，此外，对(R/S)-2HB、(R)-LA底物也均具有酶活性；PhaCRe/PhaC1Ps(STQK)对(R)-3HBCoA底物的比活力分别为0.105U/mg，0.003U/mg。 基于自主设计合成途径中三类酶的过表达结果，以(R)-2HB/(R)-3HB作为出发物，构建了三条PHA合成途径。一条合成途径中酶组成分别为ACSPt/ACTCp/PhaCRe，第二条为ACSPt/PCTTt/PhaCRe，第三条为ACSPt/PCTTt/PhaC1Ps(STQK)。每条途径中均以摩尔比分别为0/100、25/75、50/50、75/25、100/0(R)-2HB/(R)-3HB作为出发物，在不同温度下完成了反应。结果表明，三种合成体系的合成产物随着底物(R)-2HB比率的增加，产物收率下降，(R)-2HB摩尔比超过75%不能合成聚合物。产物1H-NMR结果表明，三种途径中在(R)-2HB/(R)-3HB摩尔比为0/100、25/75、50/50时，产物结构为单聚酯PHB，组分2HB未掺入。合成产物GPC结果表明，三种途径中(R)-2HB/(R)-3HB摩尔比为0/100时，合成PHB重均分子量分别为126.6KDa、164.7KDa和113.9KDa，数均分子量分别为76.5KDa、84.9KDa和64.6KDa，分散度分别为1.65、1.94和1.76。 本研究模拟PHA微生物体内代谢途径，构建的体外合成体系能够更客观地反映出合成路径中各个环节所选用酶的底物特异性和活力特性的差异，以及产物的各项性质。为PHA的微生物体内合成提供新的思路。
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