摘要
纳米抗体（Nanobody，Nb）是天然缺失轻链的重链抗体的可变区结构域（variabledomainsofheavychain-onlyantibodies，VHH）。Nb具有易于可溶性表达、亲和力与天然抗体结构类似、便于遗传操作、具有热稳定性及有机溶剂耐受性等优点，是近年来的免疫分析领域的研究热点。本研究以有机磷农药杀螟硫磷为检测对象，开展杀螟硫磷纳米抗体制备及其免疫分析方法研究，主要研究结果如下： （1）制备并鉴定了杀螟硫磷生物素化纳米抗体 以杀螟硫磷人工抗原免疫羊驼，从外周血单核细胞获取VHH基因，构建了库容量为107cfu的VHH基因文库以及滴度为1012pfu/mL的噬菌体展示文库。进行四轮淘筛得到17个阳性克隆，将候选克隆进行表达纯化获得纳米抗体，通过间接竞争酶联免疫吸附法（indirectcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay，ic-ELISA）测定17个纳米抗体的工作浓度、半抑制浓度（inhibitionconcentrationat50%，IC50）及特异性。优选对杀螟硫磷灵敏度和特异性最好的Nbjd8作为后续研究对象，其IC50为3.9ng/mL，该抗体对甲基对硫磷、对硫磷交叉反应率分别为18.8%及2.6%。 将Nbjd8基因克隆到pINQ载体，制备定向生物素化纳米抗体Nbjd8-bt。对Nbjd8、Nbjd8-bt及杀螟硫磷单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb）进行有机溶剂耐受性、热稳定性以及pH稳定性分析。结果表明两种Nbs在30%乙腈或40%丙酮中仍有80%以上的包被原结合活性，但是对杀螟硫磷的结合力明显下降；mAb在20%乙腈及丙酮中包被原结合活性仅有25%。Nbjd8-bt和mAb在热稳定性和pH稳定性方面没有明显的区别；但Nbjd8在碱性碱性缓冲液中结合活性和抑制率相对于Nbjd8-bt和mAb有所下降。 （2）建立了基于多聚辣根过氧化酶标记链霉亲和素的一步竞争ELISA方法 利用多聚辣根过氧化酶标记链霉亲和素（SA-polyHPR）作为信号放大元件，建立基于生物素化纳米抗体的杀螟硫磷一步竞争ELISA方法，在125ng/mL包被原浓度下有最佳灵敏度，IC50为1.3ng/mL，检测限（limitofdetection，LOD）为0.27ng/mL，线性范围为0.31~3.6ng/mL。选择大白菜、生菜、橘子进行添加回收实验，样品提取液经过QuEChERS净化后稀释20倍可消除基质效应，添加回收率为94.0~124.3%，变异系数为4.0~16.6%。用GC/MS以及SA-polyHRP增敏ELISA方法对蔬菜水果盲样中的杀螟硫磷含量进行检测，免疫分析检测结果与GC/MS基本吻合，相关系数为0.985。 （3）建立了基于碳点增敏策略的荧光猝灭免疫分析方法 在DMF体系中以柠檬酸和尿素在为原料，采用水热法并通过纯水透析或加碱离心两种不同纯化方法分别制得蓝色荧光碳点（bluecarbondots，bCDs）以及红色荧光碳点（redcarbondots，rCDs）。分别建立了基于oxTMB（oxidized3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）猝灭rCDs的荧光免疫分析方法和基于pNP（p-nitrophenol）猝灭bCDs的荧光免疫分析方法。基于oxTMB猝灭rCDs的荧光免疫分析方法LOD为0.088ng/mL，与icELISA相比提升4.3倍。基于pNP猝灭bCDs荧光免疫分析方法LOD为0.068ng/mL，与基于Nbjd8-AP的ELISA相比提升11.3倍。将两种荧光免疫方法用于大白菜、生菜、橘子样品检测，添加回收率为81.8~119.0%，变异系数为5.7~13.6%。 综上所述，本论文制备获得了17株杀螟硫磷纳米抗体，并优选Nbjd8克隆进行生物素化，建立了基于多聚辣根过氧化酶标记链霉亲和素信号放大的ELISA方法。进一步制备了rCDs以及bCDs，分别建立了两种荧光猝灭免疫分析方法，可以满足不同场景下杀螟硫磷的快速分析。
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