摘要
高致病性禽流感（Highlypathologyavianinfluenza，HPAI）于1878年在意大利首次报道，1996年中国广东省首次从鹅群中分离到H5N1亚型AIV。此后H5亚型AIV在全球范围内广泛流行。该病不仅对家禽业造成严重损失，还对公共卫生产生巨大威胁，迄今为止感染家禽超过2.5亿只，至少导致846人感染449人死亡。因此对H5亚型HPAIV的系统的遗传演化分析、分子进化和生物学特性研究具有重要意义。 本研究于2016年～2020年在我国部分地区养禽场和活禽交易市场分离鉴定246株H5亚型HPAIV，对其中54株进行了全基因序列测定。同时在流感共享数据库（GISAID）中下载193株全基因组序列，共计247株H5亚型HPAIV进行全基因遗传演化分析。根据8个基因的系统发育树划分分支，分析病毒基因的重配关系。研究了各基因突变位点并计算了病毒HA基因核苷酸进化速率和种群变化。选取了实验室分离到的当前流行毒株8株，研究了病毒对4周龄SPF鸡和4周龄SPFBALB/c小鼠的致病性。 本研究分离的54个毒株HA蛋白226位点、228位点和190位点均表现为禽类受体倾向性。PB2蛋白的33位点、89位点、309位点、477位点和495位点和PB1基因的13位点以及PA蛋白的631位点和615位点表明大部分毒株在这8个位点均产生了对于小鼠致病性增强的分子特点。从抗药性来看，在NA蛋白的274位点所有毒株均未产生抗NA抑制剂的分子特点，而大部分毒株的M2蛋白也基本不具有抗药性位点的突变。 对2016年～2020年间的247个毒株的HA基因进行遗传演化分析结果表明，4株属于Clade2.3.2.1c分支，243毒株均属于Clade2.3.4.4分支。其中5株属于Clade2.3.4.4b，1株属于Clade2.3.4.4c，7株属于Clade2.3.4.4g，5株属于Clade2.3.4.4f，29株属于Clade2.3.4.4d，41株属于Clade2.3.4.4e，155株属于Clade2.3.4.4h。结果揭示了2016年～2020年间，病毒流行分支有所转变，当前优势流行分支为Clade2.3.4.4h。RE-11疫苗株和rFJ56疫苗株位于相同的分支。245个毒株N6基因均属于欧亚分支，PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因进化树分别被划分为了多个分支，揭示了H5亚型HPAIV基因重配的情况。HA基因MCC树拓扑结构与ML树结构相似，计算得到进化速率为5.699E-3（核苷酸/位点/每年）。Skylineplot分析病毒的种群多样性的结果表明，HA基因在2019年左右病毒的种群多样性出现下降，Clade2.3.4.4h分支病毒的种群多样性在2017年有所上升。 本研究根据8个基因的系统发育树的拓扑结构和序列相似度划分分支，确定基因型。2016年～2020年H5亚型HPAIV至少存在32个基因型，本研究分离到的毒株可分为9个基因型（G2、G3、G11、G20、G21、G22、G23和G28），其中G2、G3、G21和G28基因型为本研究首次发现。基因型G5、G7、G9、G20、G22和G23曾连续多年出现，被称为主要基因型。其余基因型仅在同一年份出现过一次，被称为瞬时基因型。G20基因型是当前流行的优势基因型。 抗原抗体血凝抑制交叉试验结果表明，目前Clade2.3.4.4h分支的20个毒株与疫苗株RE-11的HI效价在4log2～9log2，与疫苗株rFJ56的HI效价在5log2～9log2，与疫苗株RE-11的R值在0.32～1.06，与疫苗株rFJ56的R值在0.47～1。具有一定的免疫保护作用，部分毒株与疫苗株出现了抗原差异。 致病性实验显示，7株H5亚型HPAIV对BALB/c小鼠具有高致病性，可以引起小鼠体重下降，部分小鼠出现神经症状，最终导致小鼠全部死亡。病毒可以在小鼠各脏器中检测到，病毒滴度存在差异。F909毒株不引起小鼠体重下降，仅在肺部检测到少量病毒。4株H5N6亚型HPAIV对鸡的攻毒实验显示，对鸡具有高致病性。攻毒组鸡在2～3d全部死亡，同居组在5天内全部死亡。组织脏器中均检测到较高含量的病毒。
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