猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1b和ORF2a间插入外源基因的研究

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中文摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,所有猪均易感。1987年，该病首次于美国发现，随后迅速席卷全球养猪业，仅有极少数的国家得以幸免，我国台湾地区于1991年出现了该病的报道。PRRSV一直危害着我国乃至世界养猪业的发展，但是到目前为止还没有针对PRRSV比较行之有效的手段。一直以来，国内外研制出很多种关于PRRSV的灭活疫苗和弱毒疫苗，甚至是重组疫苗，但都存在很大的局限性，或无法提供足够的免疫保护力，或可能出现毒力返强，或异源毒株交叉保护能力差，或无法区分疫苗株和野毒株。为此，以PRRSV为载体研发预防PRRSV和其他猪病原的二价甚至多价疫苗是未来PRRSV新型疫苗研究的方向。 PRRSV含有至少10个开放阅读框，大部分相邻的开放阅读框存在交叉重叠，但PRRSV病毒的ORF1b和ORF2a之间存在1个核苷酸的间隔，在该位点进行外源基因的插入不会破坏PRRSV原有的开放阅读框。本实验以PRRSV广西分离株构建的全长感染性克隆pGXAM为载体，通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）插入BstbⅠ和SbfⅠ两个酶切位点以及通过突变PCR引入转录调控序列6（TRS6），在此基础上，通过BstbⅠ和SbfⅠ两个酶切位点在PRRSV的ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白（GFP）、口蹄疫VP1蛋白等，获得以PRRSV为载体的重组质粒pGXAM-TRS、pGXAM-GFP、pGXAM-FMDV-A-VP1、pGXAM-FMDV-O-VP1。将重组质粒和pGXAM转染到乳仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）上，48h后收取300μL上清接种于非洲绿猴肾细胞（Marc-145细胞,观察细胞病变,并在体外持续传代,通过RT-PCR和间接免疫荧光等方法确定重组病毒拯救成功,重组病毒插入的外源基因至少3代内稳定。对进行重组病毒的生长特性进行研究表明，拯救出的病毒与亲本毒株拥有相似的生长动力学特性，表明插入的外源基因并不影响病毒的复制。本实验以PRRSV广西分离株为载体表达外源基因，并成功拯救出含有外源基因的重组病毒pGXAM-GFP、pGXAM-FMDV-A-VP1和pGXAM-FMDV-O-VP1,为开发重组二价甚至多价疫苗预防PRRSV等猪病原奠定了坚实的基础。

作者：

王豪

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关键词：

猪繁殖与呼吸综合征病毒外源基因 ORF1b ORF2a

授予学位：

硕士

学科专业：

兽医

导师：

韦祖樟

学位年度：

2019

学位授予单位：

广西大学

语种：

中文

中图分类号：