摘要
糖尿病及其并发症作为严重影响人类健康和生活质量的慢性非传染性疾病，已逐步发展成为全球性的重大公共卫生问题。中医药治疗糖尿病历史悠久，黄芪和桑叶是治疗糖尿病的常用药物，但黄芪和桑叶在治疗糖尿病中的协同作用机制尚不清楚。为了确定黄芪和桑叶干预糖尿病的活性成分及降血糖作用，本文通过LC-MS非靶向代谢组学技术鉴定了黄芪和桑叶中的化学成分，建立了链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型，并使用桑叶和黄芪对糖尿病患病鼠进行灌胃处理，而后基于转录组学和蛋白质组学，结合差异基因的生物信息学分析，从基因和蛋白层面推测黄芪和桑叶联用对糖尿病小鼠基因和蛋白的调控变化，并通过qRT-PCR以及Westernblot对部分显著表达的差异基因进行验证。最后，运用网络药理学从大数据角度分析黄芪和桑叶联用后的降血糖作用机制。本次研究主要得出的结论如下： （1）LC-MS对桑叶和黄芪的化学成分鉴定结果：在黄芪中，共鉴定出321种化合物，其中有76种化合物具有较好的药理学活性，主要集中在黄酮及异黄酮类物质，如黄芪素、槲皮素、芒柄花苷、染料木素等。在桑叶中，共鉴定出290种化学物质，有68种化合物具有较好的药理药效学活性，主要包括槲皮素、刺槐黄素、柑橘黄酮等在内的黄酮及异黄酮类物质，组氨酸、赖氨酸、精氨酸等在内的氨基酸类物质，以及1-脱氧野尻霉素、果糖、2-羟甲基-5-羟基-γ-吡喃酮等物质。 （2）黄芪和桑叶联用对糖尿病小鼠降血糖功效的结果：联合灌胃后，治疗组小鼠体重下降有所缓解（治疗组体重44.73±1.04g，与糖尿病组差异显著P﹤0.01，与正常组无差异），多饮多食的症状有所减轻，治疗组小鼠血糖值较灌胃前有显著下降（治疗组血糖值8.90±1.44mmol/L，与糖尿病组差异显著P﹤0.01，与正常组无显著差异），血清胰岛素水平也逐渐恢复至与正常组小鼠相当（治疗组小鼠血清胰岛素值10.93±1.59mU/L，与糖尿病组差异显著P﹤0.05），表明黄芪和桑叶联用对糖尿病小鼠血糖控制有一定的效果。 （3）转录组学的分析结果：糖尿病模型组（DC）与黄芪和桑叶联用组（DD）相比较，共筛选到699个差异基因，其中306个上调基因，393个基因表达下调。对这些差异基因进行GO和KEGG富集分析发现，差异基因主要涉及类固醇代谢、长链脂肪酸代谢、脂质生物合成过程的调控，影响辅助因子结合、单加氧酶活性、氧化还原酶活性、跨膜转运蛋白活性等，而参与的代谢通路有抗原处理和呈递、细胞色素P450代谢路径、PPAR信号通路、糖酵解和糖异生等。 （4）蛋白质组学的分析结果：对糖尿病组和黄芪、桑叶联用组小鼠的差异蛋白进行分析发现，与糖尿病模型组相比，黄芪和桑叶联用组，共筛选到1041个差异表达的蛋白，其中463个表达水平发生了上调，578个下调。而这些差异蛋白主要通过视黄醇代谢、类固醇激素生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、PPAR信号通路、胰岛素信号通路等发挥作用。 （5）转录组和蛋白质组共有差异基因的分析以及qRT-PCR验证结果：黄芪和桑叶联用组与糖尿病模型组相比，转录组中的699个差异基因与蛋白质组中的169个差异表达蛋白共有35个共有的特异基因，这些共有基因主要通过视黄醇代谢、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、C5类异戊二烯生物合成、亚油酸代谢、药物代谢-细胞色素P450代谢通路发挥作用。而后使用实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹对挑选出的28个与糖尿病有关的基因进行了验证，发现大部分结果与转录组和蛋白质组的结果一致。 （6）网络药理学分析黄芪和桑叶联用降血糖的作用机制：黄芪和桑叶的槲皮素、染料木素、花萼素、芒柄花苷等39个有效成分通过47个相应的抗糖尿病相关靶点，主要参与AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1信号通路、AMPK信号通路等25条与糖尿病治疗和预防相关的KEGG信号通路。 综上，我们对黄芪与桑叶联用降血糖的作用进行预测，推测黄芪和桑叶联用可以通过槲皮素、染料木素、花萼素、芒柄花苷等主要活性成分，调控Tap1、Ncoa4、Alas2蛋白的表达，并通过下调Fabp2、Hmox1，上调Hmgcr、Cyp7a1等基因，参与视黄醇代谢通路、细胞色素P450代谢通路、影响胆汁酸分泌、缓解铁死亡的发生从而促进糖脂类物质代谢与合成，发挥抗氧化作用，综合调节机体的糖脂代谢水平，最终维持机体的葡萄糖稳态。
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