摘要
研究目的: 免疫治疗是目前肿瘤治疗最具有发展前景的治疗手段之一。近年来，以免疫靶点PD-1/PD-L1阻断为策略的治疗在恶性黑色素瘤以及肺癌等肿瘤已批准用于临床并取得了喜人的疗效，同时在血液系统肿瘤以及肝癌、乳腺癌、肠癌以及胃癌等肿瘤的治疗中显现出较好的治疗效果。另外，以抗原特异性CTL细胞过继性治疗为手段的策略比如CAR-T、TCR-T、DC-CTL等技术也已在临床上初显成效，这两个重大进展为肿瘤免疫治疗的发展带来了新的启示。胃癌的治疗是世界性的难题，胃癌特异性抗原的选取也一直是困扰胃癌免疫治疗的难题之一。有研究发现胃癌中有一部分与EBV病毒的感染密切相关，此外还发现，这一亚类的胃癌具有较高的淋巴细胞浸润以及PD-L1基因高度扩增等特点。本研究采用目前刚兴起的三代基因敲除技术CRISPR-Cas9基因敲除系统，建立PD-1分子敲除人外周血T细胞的方法，评价其功能水平变化。并采用EBV相关抗原肽体外诱导抗原特异性CTL细胞，建立PD-1分子敲除的EBV-CTL，评价其体内外抗肿瘤作用的优势，探讨基于免疫靶点阻断联合过继性细胞免疫治疗的可行性及优势。进一步联合低剂量放疗，评估低剂量放疗对该免疫治疗的协同作用，为肿瘤免疫治疗提供新的思路和手段。 研究方法: 本研究构建hPD-1sgRNA/Cas9双质粒敲除系统，采用电转染的方法将hPD-1sgRNA/Cas9质粒共转染人外周血淋巴细胞，荧光显微镜观察转染效率，T7EN1酶切验证基因敲除效率并采用测序进一步验证突变效果;体外培养过程中观察基因改造后T细胞活力以及增殖水平，并通过流式细胞验证PD-1蛋白表达情况以及细胞亚型变化情况;采用酶链斑点检测技术(Elispot)检测肿瘤相关抗原体外再刺激PD-1敲除前后T细胞的IFN-γ分泌水平，并采用CFSE/PI标记技术检测PD-1敲除前后T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。在此基础上，采用EBV相关抗原LMP2A，通过负载自体DCs，诱导PD-1基因敲除的T细胞成为抗原特异性CTLs，检测其增殖活化能力以及免疫表型;并检测PD-1敲除CTL的细胞因子分泌水平及杀伤肿瘤细胞的能力;同时采用免疫组化的方法检测了EBV相关胃癌患者和非EBV相关胃癌患者肿瘤组织PD-1/PD-L1表达水平，并选取EBV相关胃癌患者的外周血淋巴细胞构建PD-1敲除的EBV-CTL，评价其功能;构建EBV相关胃癌的裸鼠移植瘤模型，采用低剂量放疗联合PD-1敲除CTL的细胞治疗，评估其对肿瘤的大小变化以及裸鼠的生存时间的影响。 结果: 采用电转染的方法能够有效将hPD-1sgRNA/Cas9双质粒敲除系统转入人外周血淋巴细胞，经酶切验证基因敲除效率最高达到66.67％，测序证实突变位点正确;转染后细胞扩增能力没有明显变化，经抗原活化后PD-1的表达水平较对照组明显下降;PD-1敲除组T细胞在受到肿瘤相关抗原体外再刺激后IFN-γ水平明显增高;PD-1敲除组T细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力明显增高。经证实在EBV相关胃癌患者胃癌组织的PD-L1表达水平明显高于非EBV相关胃癌患者。在PD-1敲除的T细胞的基础上，采用EBV相关抗原LMP2A诱导的CTL具有更强的IFN-γ分泌水平，并且表达EBV的胃癌细胞系有着较强的杀伤能力。在对于EBV相关胃癌的裸鼠模型中，联合低剂量放疗后该细胞治疗后抗肿瘤效果明显增强。 结论: 初步证实通过电转染方法介导的hPD-1sgRNA/Cas9质粒转染T细胞，诱导PD-1基因突变的方法有效可行，且基因改造后的T细胞经抗原诱导后具有更强的细胞应答水平以及肿瘤杀伤能力，EBV相关胃癌患者有望成为该技术治疗获益的优势人群，这一新技术的研发为肿瘤过继细胞免疫治疗提供了新的治疗策略和手段。
NETL