摘要
微钙化是部分早期乳腺癌的一个非常重要且相对特征的X线表现，也是部分乳腺癌恶性风险最可靠的临床征象之一，其与肿瘤转移和预后不良密切相关。进一步明确钙化形成的关键调控因子以及其参与肿瘤转移微环境的分子机制，对乳腺癌的诊断及后续精准治疗意义重大。 代谢重编排是癌症和细胞转化的标志。目前较多研究提示肿瘤代谢重编排可改变细胞能量的利用并调节转移相关基因的表达，进而影响癌症的发生发展过程，主要包括有氧糖酵解，脂肪形成过程和氨基酸利用等几个方面。有研究表明有氧糖酵解是癌症的代谢标志之一，Warburg效应作为肿瘤细胞主要的代谢途径，与肿瘤转移密切相关。此外，线粒体氧化磷酸化(Oxidativephosphorylation，OXPHOS)过程产生大量ATP，是细胞能量代谢最主要的来源。新兴的研究提示活跃的线粒体代谢在肿瘤发生发展、转移侵袭、癌症干性及治疗抗性等方面也发挥着关键性作用。截至目前，伴微钙化乳腺癌的发生发展机制仍未明确，其与转移及代谢相关的分子机制有待进一步研究。 一、研究目的 本研究主要分为两个部分:第一部分基于临床数据分析微钙化与乳腺癌骨转移及其它预后指标的关系;第二部分基于代谢重编排的角度初步探讨伴微钙化乳腺癌转移的分子机制。利用体外细胞成骨诱导实验模拟乳腺癌钙化形成的过程，本研究初步探讨成骨分化过程中乳腺癌细胞的不同内在代谢特征和更易发生EMT(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的分子机制。重点关注线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)在伴微钙化乳腺癌转移过程中的关键作用，明确OXPHOS过程与钙化型乳腺肿瘤转移的潜在联系，为未来临床精准靶向的治疗提供新的线索和可能性。 二、主要研究内容与方法 1、收集404例乳腺癌患者的临床、病理及影像学资料进行回顾性分析，以微钙化征象为影响因素划分为两组，即伴微钙化组和不伴钙化组，主要分析微钙化与乳腺癌骨转移及其它预后指标的关系。两组资料的比较采用两独立的样本t检验，率的比较采用x2检验，风险评估采用单因素及多因素logistic回归分析。 2、运用数据库（http://www.kmplot.com）绘制KaplanMeier生存曲线，分析钙化相关基因的差异表达与患者总体预后生存期(OverallSurvival，OS)和肿瘤无远处转移生存期（DistantMetastasis-freeSurvival，DMFS）的关系。 3、利用体外细胞成骨诱导实验模拟乳腺癌钙化形成的模型，分别对肿瘤细胞成骨分化过程中转移、代谢等相关指标进行检测。茜素红染色对钙化进行定性及定量分析;划痕和Transwell实验对肿瘤的迁移和侵袭特性进行评估;qPCR和蛋白质免疫印迹（WesternBlotting）检测相关分子的mRNA和蛋白质的表达水平;ELISA检测肿瘤细胞上清液中相关因子的分泌情况;Seahorse实验分析乳腺癌细胞中代谢相关指标的变化。用GraphPadPrism7.0软件进行作图及数据分析。 三、结果 第一部分: 1、临床数据表明:相比不伴微钙化的乳腺癌，伴微钙化的乳腺癌恶性程度更高，腋窝淋巴结受累更多见，且更容易发生骨转移和其它远处转移。微钙化作为乳腺癌患者发生骨转移的一项独立危险因素。 2、Kaplan-Meier数据库分析结果表明:OPN和RUNX2的过表达与乳腺癌患者的总体预后生存期(OS)呈负相关。OPN和ALP的过表达与短期肿瘤无远处转移生存期(DMFS)显著相关。BSP的过表达与DMFS轻度相关。 第二部分: 1、体外乳腺癌细胞成骨诱导实验模拟乳腺癌钙化形成的过程，随着成骨诱导时间的延长，乳腺癌钙化结节增多，钙化相关指标表达呈不同程度地上调，成骨诱导液(Osteogeniccocktail，OC)可在体外促进乳腺癌细胞形成钙化。 2、乳腺癌细胞在成骨分化过程中，激活了经典的TGF-β/Smad信号通路和非经典的MAPK信号通路，增强了肿瘤迁移及侵袭能力并促进了EMT的进程。 3、成骨分化过程中癌细胞转移特性的改变可能不依赖于糖酵解。 4、在成骨分化过程中肿瘤发生代谢重编排尤其是线粒体的代谢活性显著增强，癌细胞转移特性的改变可能更多依赖于线粒体氧化磷酸化的过程。 5、在成骨分化过程中通过抑制乳腺癌细胞中的线粒体OXPHOS复合物的活性，进而抑制TGFβ和MAPK信号通路的活化，最终逆转了EMT的进程。 四、结论: 1、微钙化是影响乳腺癌发生骨转移的一项独立危险因素。部分钙化相关基因(如OPN、RUNX2、ALP)在乳腺癌患者中差异表达与乳腺癌患者临床预后短生存期（OS或DFMS）相关。 2、OXPHOS复合物在钙化和EMT过程之间发挥着潜在中间桥梁的作用。干预线粒体代谢重编排可抑制TGF-β/Smad信号通路和MAPK信号通路的活化，并进一步逆转EMT的进程。靶向OXPHOS过程可能是未来钙化型乳腺癌转移治疗的关键策略。
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